Молекулярные механизмы модуляции кальциевых каналов Т-типа липоевой кислотой при проведении болевого импульса

Частота случаев острой и хронической боли, требующей терапевтического вмешательства, составляет около 10% среди жителей США; приблизительно 30% нетрудоспособных лиц страдают хронической болью. Доступные сегодня анальгезирующие лекарственные препараты имеют ограниченную эффективность или приводят к серьезным побочным реакциям. Вместе с тем неврологические аспекты механизма боли и молекулярные мишени фармакотерапии изучены недостаточно.
α-Липоевая кислота (ЛК) (тиоктовая кислота, окисленная форма) и дигидролипоевая кислота (дигидротиоктовая кислота, восстановленная форма) являются эндогенными жирорастворимыми серосодержащими митохондриальными факторами, представленными во всех клетках организма, включая нейроны. ЛК и дигидролипоевая кислота играют важную роль в реакциях цикла трикарбоновых кислот, процессах энергетического метаболизма. Кроме того, они функционируют как акцепторы («уборщики», или скавенджеры) свободных радикалов, а также участвуют в редокс-реакциях, модулирующих сульфгидрильные (тиоловые) группы различных белков.
Результаты исследований последних лет продемонстрировали, что ЛК является эффективным анальгезирующим средством при ее применении у людей и различных животных. При этом молекулярные механизмы наблюдаемого обезболивающего эффекта мало изучены.
Биофизические свойства кальциевых каналов Т-типа были впервые описаны в чувствительных нейронах еще в 1984 г., однако их функция в ноцицепции была установлена недавно. Согласно молекулярным и генетическим исследованиям, кальциевые каналы Т-типа в ноцицепторах ганглиев задних корешков (ГЗК) выступают усилителями сигнала как острой, так и хронической боли, возможно, благодаря их сильному воздействию на возбудимость этих клеток. Однако точные молекулярные механизмы, регулирующие функционирование этих каналов при возникновении боли, остаются мало ясны. Известно, что функционирование кальциевых каналов Т-типа в нейронах ГЗК in vitro и in vivo поддается модулированию разнообразными редокс-агентами.
Цель исследования группы авторов под руководством S.M. Todorovic (W.Y. Lee et al., отделение анестезиологии и проблем боли, Университет InJe, больница Sanggyepaik, Сеул, Южная Корея; отделения анестезиологии, нейронаук (в т.ч. исследования в рамках программы для выпускников), фармакологии, медицинский факультет Университета Вирджинии, Шарлотесвиль, США) заключалась в изучении следующей гипотезы: ЛК может модулировать ток в кальциевых каналах Т-типа в изолированных клетках ГЗК, а анальгезирующие свойства ЛК in vivo связаны с такой модуляцией.
Моделью для исследования in vitro послужили изолированные (диссоциированные) нейроны ГЗК взрослых крыс. Для создания рекомбинатных Ca_V3.2-каналов (с мутациями по тем или иным аминокислотным остаткам) были использованы эмбриональные клетки почки человека линии 293. Электрофизиологические исследования проводились с применением соответствующих оборудования и растворов для фиксации потенциала. Для исследований in vivo были взяты мыши Ca_V3.2 –/– (с супрессированными генами белков Ca_V3.2-канала) и мыши дикого типа в качестве контроля. У мышей определяли чувствительность к механическим и термическим стимулам. Для изучения влияния ЛК мышам проводили внутрикожные инъекции препарата (1-2 мкг) в правую заднюю лапу. Полученные результаты поддавались статистической обработке.

ЛК – убиквитарная молекула, являющаяся митохондриальным кофактором, который может проявлять свойства как антиоксиданта, так и прооксиданта, а также действовать как хелатор переходных металлов. В предыдущих работах группа исследователей под руководством S.M. Todorovic идентифицировали уникальный остаток гистидина (H191) домена I Ca_V3.2-канала. Этот остаток формирует молекулярную основу для специфической по субтипу редокс-модуляции кальциевого канала Т-типа L-цистеином. Помимо этого было показано, что L-цистеин увеличивает амплитуду тока в Т-каналах клеток ГЗК и усиливает возбудимость нейронов in vitro, а также индуцирует температурную гиперчувствительность in vivo путем хелатирования таких ионов металлов, как Zn²⁺. Кроме того, гистидиновый остаток H191 Ca_V3.2-канала может подвергнуться катализируемому металлами окислению аскорбатом в присутствии таких металлических микроэлементов, как Cu²⁺, что, в свою очередь, приводит к снижению амплитуды тока в кальциевых каналах Т-типа и возбудимости нейронов. Авторы W.Y. Lee et al. продемонстрировали, что еще одна эндогенная редокс-реактивная составляющая – ЛК – обладает не только выраженным ингибирующим эффектом на ток в кальциевых каналах Т-типа in vitro, но и, что важно, значительно снижает чувствительность к вредным термическим и механическим стимулам in vivo. Однако в отличие от L-цистеина и аскорбиновой кислоты ЛК одинаково влияет на токи в Ca_V3.1 и Ca_V3.2 – это свидетельствует о том, что H191 не является необходимым для ингибирования тока в кальциевых каналах Т-типа липоевой кислотой. Основные эффекты ЛК на ток в кальциевых каналах Т-типа реализуются через окисление специфических внеклеточных сульфгидрильных групп в доменах I и II каналов. Упомянутое окисление может приводить к конформационным изменениям структуры каналов, что, в свою очередь, может ингибировать открытие канала и в результате уменьшеньшать интенсивность входа ионов в клетку, снижать возбудимость ноцицепторов и передачу болевого импульса. Интересен тот факт, что ЛК только частично, до 40%, ингибирует ток в кальциевых каналах Т-типа. Возможно, что полная блокировка доменов I и II под влиянием ЛК отображается как частичная блокировка всего канала. В предыдущих исследованиях было показана способность некоторых других веществ (аскорбиновая кислота, 5α-востановленные нейроактивные стероиды, α-метил-α-фенил-сукцинимид, закись азота) частично ингибировать ток в нейронах ГЗК. Несмотря на неизученность точного механизма такой частичной блокады тока в Т-каналах клеток ГЗК при влиянии какого-либо компонента, результаты упомянутых исследований свидетельствуют в пользу того, что даже частичное ингибирование тока в кальциевых каналах Т-типа нейронов ГЗК является достаточным для снижения клеточной возбудимости.
В работе W.Y. Lee et al. также представлен ряд результатов, согласно которым ЛК реализует свою функцию посредством окисления внеклеточных цистеинов на нативных и рекомбинантных кальциевых каналах Т-типа. Во-первых, эффект ЛК на ток в нативных каналах клеток ГЗК уменьшается под воздействием тиол-специфического алкилизирующего агента N-этилмалеимида (NEM). Во-вторых, влияние ЛК на ток в кальциевых каналах Т-типа нейронов ГЗК не нарушалось при внутриклеточном внедрении таких сильных непроникающих через мембрану веществ, как DTNB (5,5‘-дитиобис-2-нитробензойная кислота) и MTSET (метантиосульфонат-этилтриметиламмоний), которые в определенных экспериментальных условиях имитируют эффекты ЛК. В-третьих, сайт-направленная мутация в 4 критическом цистеиновом остатке рекомбинантного Ca_V3.2-канала полностью устраняла ингибирующий эффект ЛК на ток в кальциевых каналах Т-типа. Следует подчеркнуть, что эта мутация не нарушает способность ингибировать ток других блокаторов Т-каналов: изофлурана, а также молекул, взаимодействующих с критичным гистидиновым остатком (H191) Ca_V3.2 – дитиотрентола (DTT) и Zn²⁺. Эти результаты говорят в пользу того, что мутации в критическом цистеиновом остатке не влияют на действие ЛК путем изменения функции открытия/закрытия каналов. Небольшая потенциация тока ЛК, наблюдаемая в рекомбинантных кальциевых каналах, скорее всего является следствием хелатирования металлических микроэлементов, которые вызывают тоническое ингибирование Ca_V3.2. Это подтверждается предположением, что ЛК является хелатором ионов металлов, а также установленном в представленном исследовании фактом, что ЛК ускоряет макроскопическую кинетику тока в Ca_V3-каналах с мутациями в 4 цистеиновом остатке. Аналогичные данные были получены и для других хелатирующих веществ при изучении их влияния на ток в рекомбинантных и нативных Ca_V3.2-каналах нейронов ГЗК.
Интересен тот факт, что мутации в цистеиновых остатках только частично ингибировали влияние DTNB – традиционного агента, окисляющего сульфгидрильные группы. Это свидетельствует о том, что DTNB и ЛК несколько отличаются по молекулярному механизму ингибирования кальциевых каналов Т-типа. DTNB более полно ингибирует ток в рекомбинантных и нативных Т-каналах и индуцирует потенциалозависимую модуляцию инактивации канала. В отличие от DTNB, что ЛК только частично ингибирует кальциевые каналы Т-типа, оказывая при этом минимальный эффект на потенциалозависимую инактивацию, но значительно влияя на механизм открытия/закрытия каналов. С целью выявления в Т-каналах других критических цистеиновых остатков, модулирующихся различными агентами, окисляющими сульфгидрильные группы, необходимы дальнейшие исследования.
В описываемой работе отмечено, что ингибирующий эффект ЛК на ток в кальциевых каналах Т-типа нейронов ГЗК обычно спонтанно обратим при кратковременном применении препарата. Кроме того, показано, что влияние ЛК на периферическое рецептивное поле сенсорных нейронов in vivo приводит к временному снижению температурной чувствительности. Поскольку окисление сульфгидрильных групп происходит с участием относительно стабильных дисульфидных связей, обратимость эффекта убедительно говорит о том, что с кальциевыми каналами Т-типа может быть ассоциирован неизвестный восстанавливающий фактор. Однако на данный момент предполагаемого протеина, ассоциированного с субъединицей α, которая формирует пору канала, не выявлено.
В исследованиях других авторов также сообщалось об обратимой модификации сульфгидрильных групп прочих белков при влиянии ЛК. Предполагают, что такие обратимые редокс-реакции являются основой гомеостатических или физиологических реакций организма на стресс, в то время как необратимые редокс-модификации цистеина могут в конечном счете приводить к хроническому повреждению ткани. Таким образом, кажется маловероятным, что индуцированная ЛК модуляция кальциевых каналов Т-типа в периферических ноцицепторах может оказывать повреждающее действие на ткань. Хорошо известно, что Т-каналы экспрессированы во многих участках нервной ткани, а молекулы критических остатков цистеина, которые могут окисляться ЛК, являются высоко консервативными последовательностями во всех изоформах у разных видов. Поэтому возможно ли, что ингибирование ЛК кальциевых каналов Т-типа в ЦНС играет роль в центральной модуляции передачи болевого импульса и других физиологических функциях? Ответ, очевидно, будет основываться на том, что пиковая концентрация ЛК в плазме после системного применения у людей колеблется в диапазоне 5-50 мкмоль и, как показано в исследовании W.Y. Lee et al., в таких концентрациях ЛК ингибирует приблизительно на 25-35% ток в кальциевых каналах Т-типа нейронов ГЗК. Помимо этого, имеется достаточно данных, согласно которым применение ЛК при лечении боли является безопасным подходом. Использование ЛК в терапевтических концентрациях ассоциируется с развитием малого количества побочных реакций по сравнению с другими обезболивающими средствами.
По данным проведенных ранее исследований in vitro ЛК в миллимолярных концентрациях может модулировать ток в NMDA-каналах (рецепторах, селективно связывающих N-метил-D-аспартат) культивированных нейронов коры головного мозга. Кажется маловероятным, что упомянутый эффект имеет отношение к описанному выше влиянию ЛК in vivo на восприятия боли, поскольку NMDA-каналы в физиологических условиях не вносят значительного вклада в периферическую ноцицепцию. Однако возможно, что купирование нейропатической боли происходит вследствие ингибирующего эффекта ЛК как на ток в NMDA-каналах в ЦНС, так и на ток в Т-каналах нейронов ГЗК. Согласно полученным W.Y. Lee et al. данным, ЛК существенно угнетала рефлекс отдергивания лапы (хотя эффект и был временным) в ответ на вредные термические и механические стимулы – тест, по которому обычно определяют анальгезирующий эффект периферического генеза. У людей более продолжительное обезболивающее влияние можно достичь при использовании препаратов замедленного высвобождения в виде кремов – такой подход может эффективно применяться в лечении состояний, сопровождающихся термической гипералгезией (например, солнечные ожоги). Более периферические ноцицепторы являются полимодальными, и у мышей с супрессированными генами белков Ca_V3.2-канала заметно снижалась интенсивность ответа на резкие термические, механические и химические (формалин, капсаицин) стимулы. Кроме того, периферические кальциевые каналы Т-типа вовлечены в явление хронической нейропатической боли при таких патологиях, как механическое повреждение нерва или диабетическая нейропатия. Соответственно, местное применение ЛК и подобных эндогенных окисляющих агентов, которые влияют на Ca_V3.2-каналы в периферических ноцицепторах, может снижать периферическую повышенную чувствительность, приводящую к развитию хронической нейропатической боли.

Реферативный обзор подготовила Наталия Ткаченко