Потенційні мішені впливу лікарських засобів з антитромбоцитарною дією

Проблема атеротромбозу (АтТ) – процесу утворення тромбів в атеросклеротично змінених судинах – не нова. Це захворювання є причиною смертності 30% населення земної кулі. За статистичними даними, ураження більше ніж однієї судинної зони (коронарної, церебральної або периферичної) зустрічається у 26% пацієнтів [1]. При цьому серед хворих з АтТ після перенесеного інфаркту міокарда (ІМ) ризик виникнення повторного ІМ збільшується в 7 разів, а інсульту – в 4 рази. Після перенесеного інсульту ймовірність розвитку ІМ стає вищою втричі, інсульту – в 9 разів. Ураження периферичних артерій збільшує ризик розвитку ІМ у 4 рази, інсульту – у 3 рази [18-20]. Зважаючи на вищеперераховані статистичні дані, з упевненістю можна сформулювати попередній висновок: АтТ є основною причиною смертності населення у світі загалом та в Україні зокрема [2]. Природно, що проблема АтТ привертає увагу науковців, відбувається постійний пошук нових лікарських засобів, які впливатимуть на процес АтТ, а саме на тромбоцитарну ланку гемостазу.
Коагуляційна система крові – це складний багатокомпонентний комплекс, який забезпечує збереження цілісності організму людини за рахунок постійного підтримання рідкого стану крові, формування спрямованого тромбозу за принципом on demand («за вимогою»), активізації репаративних процесів у місцях судинних і тканинних пошкоджень [3]. Коагуляційні процеси в організмі забезпечують такі структури: 1) судини та безпосередньо судинна стінка; 2) клітини крові, а саме кров’яні пластинки (тромбоцити); 3) система адгезивних молекул плазми крові; 4) система зсідання крові; 5) система фібринолізу; 6) система первинних і вторинних антикоагулянтів (антипротеаз); 7) система первинних репарантів (загоювачів) [4-6].
Усі фази гемостатичного процесу характеризуються участю тромбоцитів [7]. Початком цього процесу є травма чи розрив судини, а результатом – утворення тромбоцитарно-фібринової сітки. Тромбоцити на 50% забезпечують тромбопластинову та на 87% – антитромбінову активність плазми.
У реалізації функцій первинного (тромбоцитарно-судинного) гемостазу (утворення так званої тромбоцитарної пробки) розрізняють 7 основних фаз тромбоцитарних реакцій та взаємодій: адгезію, розпластування, реакцію вивільнення, агрегацію, ретракцію кров’яного згустку, експонування 3-го тромбоцитарного фактора, активацію каскадів системи зсідання крові. 
Участь тромбоцитів у гемостазі визначається такими їх функціями: а) ангіотрофічною; б) здатністю підтримувати спазм пошкоджених судин через секрецію вазоактивних речовин (серотоніну, катехоламінів, β-тромбомодуліну), які містяться в щільних і α-гранулах тромбоцитів; в) спроможністю утворювати в пошкодженій судині тромбоцитарну пробку шляхом адгезії цих клітин до субендотелію та формуванням їх агрегатів; г) участю тромбоцитарних факторів у процесі зсідання крові та регуляції фібринолізу; ґ) стимуляцією процесів репарації в місцях пошкодження судинної стінки за допомогою виділеного адгезованими тромбоцитами тканинного фактора, котрий стимулює розмноження й переміщення гладком’язових клітин та ендотеліоцитів, а також утворення колагену. Тромбоцити виконують роль захисної блокади, оскільки перебувають у плазмовому шарі, причому частина з них – поблизу ендотелію, «заклинюючи» міжклітинні щілини та утворюючи подобу «матрацу», який має ключове значення для збереження нормальної проникності капілярів [8-10]. 
Активація тромбоцитів є надзвичайно важливим етапом гемостатичного процесу, бо саме вона лежить в основі як нормального гемостазу, так і патологічного утворення тромбів і є пусковим механізмом у повноцінній тромбоцитарній адгезії та агрегації. Активація тромбоцитів стосується практично всіх компонентів цих клітин. Сигнал індукуючого чинника передається від периферичних (рецептори) до глибинних структур клітини. В результаті з неї вивільнюється велика кількість протеїнів (зокрема ферментів), іонів і біологічно активних речовин. 
Активними тромбоцитами є такі, на поверхні яких знаходяться реакційно здатні комплекси в кількості, достатній для встановлення зв’язків з іншими кров’яними пластинками. Тоді швидкість активації тромбоцитів буде визначатися концентрацією індуктора, а швидкість утворення агрегатів – кількістю активних тромбоцитів. На етапі міжклітинної взаємодії активні тромбоцити з’єднуються між собою. Їхня кількість у кровотоці здорової людини становить у середньому 20-40%.
Процес активації тромбоцитів стадійний. Послідовність змін у структурі та функціонуванні клітин під час їхньої активації можна представити у вигляді п’яти біохімічних стадій.
I. Iнiцiацiя активації тромбоцитiв зумовлена утворенням комплексу індуктора зі специфiчним мембранним рецептором. Результатом цiєї взаємодії є активацiя мембранозв’язаного ферменту фосфолiпази A₂ з утворенням двох продуктiв – арахiдонової кислоти та лiзоформи фактора активації тромбоцитiв (лiзо-ФАТ). Субстратом цієї реакції слугує молекула фосфолiпiду фосфатидилхолiну, який міститься в зовнiшньому шарi цитоплазматичної мембрани (ЦПМ) тромбоцита. На частку фосфатидилхоліну припадає 26% вiд загального вмiсту лiпiдiв у ЦПМ.
Пiд дiєю ферменту циклооксигенази (ЦОГ) арахідонова кислота швидко конвертується в циклiчнi ендопероксиди, якi за механiзмом негативного зворотного зв’язку iнгiбують активнiсть ЦОГ. Продуктом реакції, що каталiзується ферментом тромбоксансинтетазою, є тромбоксан А₂ (ТхА₂) – сильний iндуктор агрегації та вазоконстриктор. Iншим потужним iндуктором агрегації є ФАТ, що утворюється з промiжної сполуки лiзо-ФАТ.
Таким чином, під час І стадії активації тромбоцитiв утворюються 2 активних iндуктори, при цьому одна молекула колагену стимулює синтез 1000 молекул ФАТ i ТxА₂. Загалом І стадiя не супроводжується помiтними змiнами форми та адгезивної здатностi тромбоцитiв.
II. Ауто- i паракринний механiзм активації тромбоцитiв пiд впливом ФАТ i ТхА₂ опосередкований специфiчними мембранними рецепторами i залежний від стимуляцiї активностi мембранозв’язаного ферменту фосфолiпази С. Результатом ферментативного гiдролiзу фосфатидилiнозитолдифосфату є утворення двох сполук: 1,4,5-iнозитолтрифосфату й дiацилглiцеролу, які мають властивостi вторинних посередникiв («месенджерів»). 
Ключова ланка ІІ етапу активації тромбоцитiв – мобiлiзацiя iонiв Са²⁺ iз внутрiшньоклiтинного депо. Іонiзований кальцій виступає основним регулятором послiдовностi тромбоцитарної активації.
III. Фаза первинної (зворотної) агрегації тромбоцитiв. До основних внутрiшньоклiтинних процесiв, якi перебувають пiд контролем внутрiшньоклiтинного рiвня Са²⁺, належать: позитивна модуляцiя активностi мембранних фосфолiпаз A₂ i С; експресiя на поверхнi клiтин глiкопротеїнових рецепторiв фiбриногену та інтегринових комплексiв; пригнічення аденiлатциклазного і гуанiлатциклазного шляхiв, що гальмують стимуляцiю тромбоцитiв; робота скоротливого апарату тромбоцитiв, яка визначає змiну їхньої форми, секрецiю та вивiльнення вмiсту внутрiшньоклiтинних гранул.
Можливiсть переходу тромбоцитiв iз III у IV стадiю активації визначається як внутрiшньоклiтинним механiзмом регуляції, так i гальмiвними екстрацелюлярними стимулами, дiя яких реалiзується через аденiлатциклазну та гуанiлатциклазну системи трансдукції сигналу. На зовнішньоклiтинному рiвні провiдне значення мають простациклiн i NO (оксид азоту). У тромбоцитах цю гальмiвну роль вiдiграють циклічні аденозинмонофосфат (цАМФ) і гуанозинмонофосфат.
IV. Стадiя дегрануляції. У ходi реакції вивiльнення з тромбоцитiв через їхню вiдкриту канальцеву систему видiляються аденозиндифосфат (АДФ), ФАТ, вазопресин, серотонiн, адреналiн, ТхА₂, якi залучають до агрегації також iншi тромбоцити. Для розвитку необхiдної за інтенсивністю агрегації важливим є вивiльнення в позаклiтинний простiр АДФ. 
V. Кiнцевi етапи активації тромбоцитiв пов’язанi з екстрапозицiєю ними рецепторiв фiбриногену – глікопротеїнового комплексу IIb/IIIa, який на вiдмiну вiд iнших глікопротеїнів (ГП) мембран з’являється тiльки в процесi активації тромбоцитiв. З’ясовано, що на поверхнi тромбоцитiв iснує вiд 50 000 до 100 000 рецепторiв типу IIb/IIIa.
Активація тромбоцитів розпочинається лише тоді, коли пошкоджено судинний ендотелій і оголено субендотеліальний матрикс [11]. Адже нормальний ендотелій діє як потужна антикоагулянтна поверхня, котра не активує білки зсідання крові та не залучає до цього процесу клітинні елементи. Навпаки, він, по-перше, поставляє до субендотелію низку речовин (компоненти базальної мембрани, колаген, еластин, ламінін, протеази та їх інгібітори, тромбоспондин, мукополісахариди, вітронектин, фібронектин, фактор Віллебранда [ФВ]), які сприяють міжклітинній взаємодії та утворенню дифузійного бар’єра з метою запобігання потрапляння крові з внутрішньосудинного простору в позасудинний. По-друге, він секретує в просвіт судини глікозаміноглікани, комплекси гепарин/ гепаринсульфат-антитромбін ІІІ, тромбін-тромбомодулін-протеїн С, плазміноген-активатор плазміну, які сприяють плинності крові. По-третє, він продукує простациклін (простагландин І₂) та ендотеліальний фактор релаксації – два можливих інгібітори адгезії та агрегації тромбоцитів. Після стимуляції чи травми ендотелій трансформується в потужну прокоагулянтну систему. Це відбувається за рахунок синтезу й виділення багатьох прокоагулянтних речовин, зокрема тканинного фактора, ФВ, фактора V, інгібіторів активатора плазміногену 1 і 2, інтерлейкіну 1, туморнекротизуючого фактора, ендотеліну 1. 
У сучасній літературі наводяться дані про подібність початкових ланок процесу активації ендотеліальних клітин та тромбоцитів [12, 13]. Так, з’ясовано, що експресія адгезивної молекули Р-селектину на поверхні обох згаданих структур є одним із найперших проявів їхньої активації, що дозволяє тромбоцитам не лише приєднуватися до пошкодженого ендотелію, але й зв’язуватися з нейтрофільними гранулоцитами та моноцитами. Фактично циркулюючі тромбоцитарно-моноцитарні агрегати можуть точніше відбивати ступінь активації тромбоцитів, аніж визначення експресії Р-селектину на їхній поверхні. Гіперхолестеринемія приводить до підвищення рівня Р-селектину в плазмі. Це може трактуватися як один із механізмів, за допомогою якого гіперхолестеринемія підвищує схильність до тромбозів. 
СD40 являє собою трансмембранний білок, який належить до родини туморнекротизуючого фактора. З’ясовано, що тромбоцити при активації можуть експресувати на своїй поверхні ліганд СD40 (СD40L), при цьому більше 90% СD40L мають тромбоцитарне походження. СD40L є одним із медіаторів запалення. Після від’єднання від поверхні тромбоцитів він активує каскад запальних реакцій, до якого залучені такі білки, як Е-селектин, VCAM, ICAM. Отже, тромбоцитарний СD40L може стимулювати ендотеліальні клітини до секреції різних хемокінів, які, у свою чергу, залучають лейкоцити. Це один із механізмів запуску тромбоцитами запальної відповіді. Приєднання синтезованого тромбоцитами СD40L до ендотеліальних клітин може приводити до експресії тканинного фактора – потужного прокоагулянта. Таким чином, СD40L через рецептори до СD40 дозволяє тромбоцитам приєднуватися до макрофагів, Т-лімфоцитів, ендотеліальних клітин. Було встановлено, що СD40L за рахунок його KGD-послідовності здатен приєднуватися до рецепторів IIb/IIIa і саме цей зв’язок несе відповідальність за стабілізацію тромбу [17]. 
СD40L має властивість підвищувати секрецію моноцитарного хемотаксичного пептиду-1 мононуклеарами, а також сприяти розриву атеросклеротичної бляшки через синтез матриксних металопротеаз. Високі рівні циркулюючого СD40L здатні блокувати міграцію ендотеліоцитів, що має згубний вплив при ерозії та розриві атеросклеротичної бляшки. Крім того, існують дані про те, що СD40L може призводити до прогресування атеросклерозу. Таким чином, активація тромбоцитів, яка запускає процес запалення, потенційно може бути пригнічена деякими групами антитромбоцитарних лікарських засобів.
Поряд із СD40 потужними підсилювачами тромбозу й запалення виступають компоненти RANTES (регулятори активації процесів експресії та секреції нормальних Т-лімфоцитів). Міграція моноцитів до місць ушкодження ендотелію відбувається після накопичення в них RANTES. Доведено, що антагоністи рецепторів RANTES знижують інтенсивність формування неоінтими та макрофагальної інфільтрації. Іншими учасниками тромбозу і запалення є мікрочастинки PDMP, які вивільнюються активованими тромбоцитами й нагадують собою маленькі пухирці. PDMP беруть участь в адгезії тромбоцитів до пошкодженого ендотелію; шляхом експресії Р-селектину вони сприяють агрегації лейкоцитів.
У неушкодженій судині тромбоцити не взаємодіють один з одним і не адгезують, що пояснюється їхнім електростатичним відштовхуванням від ендотелію. 
Раннім проявом активації тромбоцитів є процес їх сферизації – перехід від дископодібної форми до сферичної з виростами у вигляді псевдоподій, що забезпечується внутрішньоклітинною системою скоротливих мікрофіламентів. 
Важливу роль у реалізації процесів адгезії та агрегації клітин відіграють ГП. Молекули цього типу складаються із зовнішніх доменів, що діють як рецептори та зв’язуються з позаклітинними адгезивними ГП (фібриногеном, колагеном, ФВ), і трансмембранних пептидів, які фіксують ГП та опосередковують процеси активації тромбоцитів. Більшість тромбоцитарних ГП, за винятком Іb-IX, кодуються генами інтегринової родини. 
Одним із важливих наслідків активації тромбоцитів уважається модифікація комплексу мембранних ГП IIb/IIIa, який у результаті конформаційних змін набуває здатності до зв’язування фібриногену. ГП IIb/IIIa є «диригентом» цілого комплексу функцій. Фібриноген, який взаємодіє з IIb/IIIa, утворює «містки» між активованими тромбоцитами, завдяки чому відбувається агрегація тромбоцитів, що завершується формуванням у зоні пошкодження судинної стінки тромбоцитарного («білого») тромбу. Фібриногенові «містки» стабілізуються тромбоспондином – компонентом α-гранул, який виділяється при активації тромбоцитів. Утворення продукту гуморального коагуляційного каскаду – тромбіну посилює агрегацію тромбоцитів, оскільки тромбін є її потужним агоністом. Не лише тромбін активує тромбоцити, але й тромбоцити, у свою чергу, сприяють утворенню тромбіну. 
Активацію тромбоцитів, зміну їх форми, секрецію та агрегацію через вторинні посередники забезпечують АДФ-рецептори [15], різновидами яких є Р2Y1 та Р2Y12. Вплив на рецептор Р2Y12 приводить до пригнічення аденілатциклази та зниження концентрації цАМФ, котрий сприяє секреції тромбоцитами протромботичних медіаторів і процесу агрегації. Рецептор Р2Y1 забезпечує потік кальцію всередину клітини, змінюючи форму тромбоцитів. Дефіцит цих рецепторів викликає пригнічення АДФ-, адреналін- та колагеніндукованого тромбозу. У пацієнтів з мутацією хромосоми 3 встановлено дефект рецептора Р2Y12, що призводить до геморагічних розладів. Клонування Р2Y1 дало би змогу прискорити розробку нових фармакологічних препаратів, дія яких спрямована на цей рецептор. Одночасна подвійна блокада рецепторів Р2Y1 та Р2Y12, імовірно, приведе до істотного пригнічення тромбоутворення (хоча потенційно може зумовлювати і значні кровотечі).
ФВ – адгезивний протеїн, який викликає велику зацікавленість на сучасному етапі. Він синтезується клітинами ендотелію, перебуває у специфічних органелах (тільцях Вайбела – Пелейда), а також мегакаріоцитах. Виступає переносником фактора VIII зсідання крові та кофактором адгезії тромбоцитів до субендотелію судин [13, 16].
Найяскравішим прикладом літературної рубрики «Що нового у старому?» є те, що протягом останнього десятиліття тромбоцити розглядаються як потужне джерело маркерів запалення. Ці спостереження досить тривалий час ігнорувались. Установлено, що транскрипторний апарат тромбоцитів складається в основному з матричної рибонуклеїнової кислоти (мРНК), яка кодує запальні білки. α-Гранули тромбоцитів містять модулятори запалення, такі як Р-селектин, тромбоспондин 1, а також фактор тромбоцитів 4, який трансформує фактор росту β та RANTES. Звідси випливає, що тромбоцити не є пасивними учасниками гемостазу, а виконують активну біосинтетичну роль, сприяючи продукції білків, які беруть участь у процесах тромбозу та запалення. Більш ретельне вивчення транскрипторного апарату тромбоцитів дозволить відкрити нові мішені для фармакотерапії. Так, випадковим чином було встановлено, що активація мРНК тромбоцитів викликає синтез запального медіатора-попередника інтерлейкіну 1β. Медіатори апоптозу, адгезії клітин, запалення та тромбозу в достатній кількості синтезуються тромбоцитами, особливо за умови їх активації. Наявність мРНК, які кодують каспази, остеонектин, убіхітин, віментин, тканинний інгібітор матриксної металопротеази І типу, свідчить про потенційну багатогранну роль тромбоцитів в ангіології.
Відкриття за допомогою геномних технологій поліморфізму поодиноких нуклеотидів (ППН), який впливає на процес тромбоутворення, може сприяти знаходженню абсолютно непередбачених мішеней для терапевтичних втручань. Так, ППН тромбоспондину пов’язаний із підвищеним ризиком розвитку ІМ. Отже, ефективною з терапевтичного погляду може стати регуляція активності тромбоспондину. Рецепторний комплекс тромбоцитів Іb-V-IX здатен приєднувати не тільки ФВ, але й тромбін. ППН у цьому рецепторі, що зумовлює існування таких алелей, як VNTR A та VNTR B у ГП Іbα-5, алель 1 інтегрину α₂, може підвищувати ризик тромбозу. Поліморфізм ГП Іba асоціюється з ангіографічно вираженою ішемічною хворобою серця. Поліморфізм двох нуклеотидів ГП Іba – HPA-2 (Thr145Met) і VNTR B пов’язують із ризиком настання раптової коронарної смерті.
Важливе значення мають тромбоцити у вторинному (макроциркуляторному) гемостазі. Відомо, що мегакаріоцити синтезують та депонують в α-гранулах фактори зсідання крові V, VIII, XIII, ФВ, фібриноген. Ці фактори вивільнюються в мікросередовище при активації тромбоцитів та екзоцитозі, що підвищує їхню локальну концентрацію. Позаклітинні адгезивні ГП (фібронектин, остеонектин, вітронектин) також депонуються в α-гранулах тромбоцитів і секретуються при їх активації [2]. 
Тромбоцитарні ЦПМ відіграють не менш важливу роль у запуску специфічних реакцій зсідання. Ліпопротеїн ЦПМ, так званий фактор 3, є сильним каталізатором при активації фактора Х факторами ІХа та VIII та утворенні протромбінази за рахунок взаємодії між факторами Ха і V. Цьому сприяє складна реакція тромбоцитів на активацію, що включає феномен «flip-flop», завдяки якому фосфоліпіди, котрі мають високий негативний заряд та виражену прокоагулянтну активність, пересуваються з внутрішньої поверхні ЦПМ на зовнішню, у зв’язку з чим різко зростає афінність ЦПМ до плазмових факторів зсідання крові. 
Порушення функціональної активності рецепторів і системи вторинних посередників є ланкою механізму порушення функції тромбоцитів. 
Роль тромбоцитів у процесі утворення тромбу схематично представлено на рисунку. 
Слід також зазначити про роль тромбоцитів в обмеженні зсідання крові. Мембрана активованого тромбоцита зв’язує тромбін та тромбомодулін, які разом викликають активацію антикоагуляційного протеїну С. Особлива увага нині прикута до питань, пов’язаних зі значенням тромбоцитарної регуляції фібринолітичної системи. Ферменти, що сприяють утворенню плазміну, зазвичай фіксуються на поверхні ЦПМ тромбоцитів. Сюди також приєднуються плазміноген і тканинний активатор плазміногену (ТАП). Утворений та фіксований на тромбоцитах плазмін захищений від інактивації α₂-антиплазміном, а отже, має більший час напівжиття [14]. З огляду на здатність тромбоцитів фіксуватись у найбільш тромбонебезпечних місцях, їх можна розглядати як своєрідний постачальник плазміногену до найзагрозливіших ділянок. Разом із тим тромбоцити вважаються носіями інгібіторів активатора плазміногену 1. Який з ефектів – активація плазміногену чи його пригнічення – буде превалювати, залежить від ступеня активації тромбоцитів та афінності їхньої поверхні до молекулярних структур. Функціональний зв’язок тромбоцити – плазмін є двостороннім. Так, плазмін, який щойно утворився на тромбоциті, щільно приєднується до його поверхні в низьких концентраціях, розщеплює субодиниці ІІІа тромбоцитарних рецепторів до фібриногену. В такий спосіб знижується здатність поверхні тромбоцитів до адгезії та агрегації. При збільшенні концентрації плазмін набуває здатності безпосередньо активувати кров’яні пластинки. Активовані тромбоцити захоплюють та фіксують на своїй поверхні нові молекули плазміногену і ТАП, збільшуючи потужність каталітичної активації плазмінової системи. На сучасному етапі активація плазміногену за допомогою ТАП розглядається як аутокаталітичний процес, що відбувається на поверхні тромбоцитів і зумовлений реципрокною взаємодією між ними та компонентами системи плазміногену [7]. 
Таким чином, вищенаведені дані свідчать про неабияку роль тромбоцитів у процесах зсідання крові, запалення, фібринолізу та про необхідність подальших досліджень для з’ясування незрозумілих питань щодо механізмів їх регуляції. Нове розуміння клітинних і генетичних рівнів тромбоутворення сприятиме розробці сучасних антитромбоцитарних лікарських засобів, здатних пригнічувати активність тромбоцитів більш ефективно та безпечно. Цілком нові підходи до антитромбоцитарної терапії, вочевидь, будуть розроблені вже після остаточного встановлення продуктів синтезу на тромбоцитарній мРНК. Відкриття ППН і гаплотипів, пов’язаних із посиленням протромботичних тенденцій, дозволить визначити нові мішені для майбутньої антитромбоцитарної терапії.

Список літератури знаходиться в редакції