Ядерный фактор κB (NF-κB) как важный патогенетический фактор и новая мишень в лечении ревматических заболеваний

Нуклеарный (ядерный) фактор κB (kappa B – «каппа-би»; NF-κB) является одним из главных транскрипционных факторов, отвечающих за адаптивные реакции клеток [23, 24, 30]. Он представляет семейство цитоплазматических белков, которые при стимуляции переходят в свободное состояние, перемещаясь в ядро, где проявляют активность, связываясь с промоторными участками более чем 100 генов (по другим данным, более 300), ответственных за индуктивный гомеостаз.

NF-kB играет важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, поскольку он регулирует экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [6, 41]. Он представляет собой гетеродимерный комплекс белков семейства Rel, которые в большинстве покоящихся клеток неактивны и находятся в цитоплазме в комплексе со специфическими ингибирующими белками IκB (inhibitors of kappa B), семейство которых включает IκBα, IκBβ, IκBγ/р105, IκBδ/р100, IκBε и фактор-3 В-клеточной лимфомы (Bcl-3).

Семейство NF-κB представлено пятью белками – р50/105 (NF-κB1), р52/100 (NF-κB2), р65 (RelA), c-Rel и RelB [22]. Их NH2-конец имеет Rel-гомологичный домен (он состоит из 300 аминокислот), который обеспечивает внутриядерный транспорт NF-κB, его взаимодействие с ДНК и ингибиторами, а также образование димерных молекул [41, 42]. Несмотря на множество форм, основной классической формой существования этих белков в большинстве типов клеток является гетеродимер p50/RelA (p65). Он содержится в большинстве клеток и имеет практически все участки, необходимые для связывания с индуцибельными генами.

Димеры NF-κB находятся в цитоплазме покоящейся клетки в неактивной форме, связанные с одним из ингибирующих белков IκB. Фосфорилирование IκB так называемым IKK (IκB kinase)-комплексом в ответ на различные стимулы приводит к их протеолитическому расщеплению и активации NF-κB, который затем перемещается в ядро клетки, где связывается с промоторным участком специфического гена и запускает процесс транскрипции [22, 42]. Провоспалительные цитокины интерлейкин 1β (IL-1β) и туморнекротизирующий фактор α (TNF-α), продуцируемые макрофагами и другими клетками, влияют на клетки-мишени (лейкоциты, эндотелий сосудов, гладкомышечные клетки, кардиомиоциты, фибробласты), активируя NF-κB. По механизму положительной обратной связи в результате активации NF-κB в плазме крови повышается уровень провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α [51]. Продукция IL-6, индуцируемая при активации NF-κB, приводит к системным признакам воспаления. Схема классической активации NF-κB представлена на рисунке 1.

Активацию NF-κB вызывают физические и химические факторы (радиация, ультрафиолетовый свет, повышенное давление, окислительный стресс, присутствие форболовых эфиров и др.), инфекционные агенты (бактерии, вирусы, паразиты и их продукты), сигнальные молекулы (гормоны, цитокины, ростовые факторы, цАМФ и др.). NF-κB влияет на различные гены, задействованные в иммунном, острофазовом и воспалительном ответах. К ним принадлежат: гены IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-6, IL-12, IL-8 и других хемокинов; индуцибельных ферментов (iNOS, CОХ-2); молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1, Е-селектина); главного комплекса гистосовместимости (MHC-I, MHC-II); белков комплемента (В, С3, С4); факторов, контролирующих клеточный цикл (р53, циклина D1 и др.); ингибиторов и активаторов апоптоза (с-IAP1, c-IAP2, FasL, Bcl-2, TRAF-1, TRAF-2 и др.) [19, 22, 33]. Индукторы NF-κB и последствия активации NF-κB схематически представлены в таблице 1.

NF-κB опосредует воспалительный и иммунный ответ, реакцию на вирусные инфекции, деление клеток и регуляцию апоптоза. Он может быть задействован как в анти-, так и в проапоптотическом сигнале. Активация NF-κB обычно задерживает апоптоз, продлевая жизнь клеток-эффекторов в очаге воспаления, например, при ревматоидном артрите (РА), бронхиальной астме, хронических заболеваниях нервной системы, кишечника, атеросклерозе, септическом шоке и др.

Своеобразность экспрессии и сложность структуры NF-κB особо показательны при РА. Так, при РА синовиальные фибробласты секретируют IL-6, активируя р50 и р65 [3, 41], тогда как тромбин побуждает эндотелиоциты к синтезу ICAM-1 через активацию р65 [19]. Гетеродимеры р50 и р65 вовлечены в IL-1- и TNF-α-зависимую стимуляцию моноцитарных воспалительных генов; эффект блокируется цитокином IL-10. Специфика NF-κB-опосредованных реакций дополняется особенностями регуляторных IKK-IκB молекул, которые наряду с обилием NF-κB-связывающих ДНК-сайтов обеспечивают чувствительность к множеству стимулов. Сюда следует добавить химические реакции, влияющие на структуру активированного NF-κB (от них зависит его транскрипционная активность) – ацетилирование, фосфорилирование, S-нитрозилирование [3, 4, 23]. Все это создает картину (но, к сожалению, неполную!) поливалентной активации NF-κB, которая допускает множество регуляторных (возможно, избыточных) путей, ведущих к реализации эффекторного потенциала клеток.

А все начиналось около 20 лет назад, когда группа ученых под руководством будущего Нобелевского лауреата Дэвида Балтимора обнаружила в мышиных В-лимфоцитах регулятор гена легкой κ-цепи иммуноглобулинов, который получил название транскрипционного нуклеарного фактора κB (NF-κB). Вскоре оказалось, что NF-κB присутствует во всех клетках взрослого организма, занимая центральные позиции в регуляции огромного количества генов [4].

Очевидно, что NF-κB играет важную положительную роль в нормальном функционировании клетки, а нарушение NF-κB-опосредованного регулирования оказывается вовлеченным в патогенез целого ряда заболеваний. Прежде всего это воспалительные и ревматические патологии: ревматоидный артрит, остеоартроз (ОА), системная красная волчанка, спондилоартрит (СпА), атеросклероз, воспалительные заболевания кишечника, астма, хронические воспалительные демиелинизирующие полирадикулоневриты, Helicobacter pylori-ассоциированные гастриты, диабет 2 типа, рак, иммунодефицитные состояния, кахексия, нарушения функции щитовидной железы, болезнь Альцгеймера и др. В таблице 2 представлены ревматические заболевания, патогенез которых связан с активацией NF-κB.

Было показано, что NF-kB участвует в дифференцировке и активации иммунных клеток, в том числе макрофагов, дендритных клеток, гранулоцитов, а также остеокластов и хондроцитов [50]. Дифференциация моноцитов (предшественников макрофагов) требует NF-kB-зависимой транскрипции антиапоптических генов. NF-κB как «главный переключатель» является основным регулятором физиологических функций и воспалительного ответа. Различные молекулы, взаимодействуя с NF-κB, способствуют индукции или торможению воспалительного процесса.

NF-κB и ревматоидный артрит. Факт активации NF-κB в синовиальной ткани имеет большое значение для течения РА. Действительно, р50 и р65 субъединицы NF-κB в изобилии выявляются в синовиальной ткани при РА, а также в меньшем количестве – при ОА. Исследование синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом и СпА показывают, что число клеток, экспрессирующих NF-κB1 на границе хряща с паннусом, значительно выше, чем в других районах [10]. Аналогичные данные получены относительно клеток, экспрессирующих RelA в синовиальной оболочке больных РА, но не в синовиальной оболочке пациентов со СпА.

Экспериментальные модели артрита у животных также подтверждают ведущую роль NF-κB в развитии и прогрессировании заболевания. Активация NF-κB до начала клинических проявлений была обнаружена при коллаген-индуцированном артрите у мышей и адъювантном артрите у крыс. В первой модели активность NF-κB коррелировала с активностью матриксных металлопротеиназ (ММР) – коллагеназой-3 (ММР-13) и стромелизином-1 (ММР-3) [21]. Сдвиг к ядерной локализации NF-κB был также выявлен в хондроцитах на ранних стадиях артрита у мышей, иммунизированных коллагеном II типа [17]. Во второй модели активированная субъединица NF-κB р65 была обнаружена в синовиальных клетках [49].

NF-κB также играет важную роль в остеокластогенезе и потере костной ткани, индуцированной воспалением. Триада остеопротегерин-RANK-RANKL, в частности, определяет костный гомеостаз. Недавние экспериментальные исследования продемонстрировали, что активация IKK-β необходима для передачи сигнала с RANK на NF-κB. Этот процесс также происходит в значительной степени за счет участия (в качестве вторичного мессенджера) факторов семейства TRAF (TRAF2), передающих управляющий сигнал через IKK – ингибитор κB киназного комплекса (Ik). Под действием IKK происходит фосфорилирование kB киназного комплекса и его отсоединение от транскрипционного фактора NF-κB. В результате транскрипционный фактор NF-κB получает возможность транслоцироваться в ядро и активировать транскрипцию генов, определяющих дифференцировку остеокластов [48]. Таким образом, классический («канонический») путь активации NF-κB имеет решающее значение для остеокластогенеза в естественных условиях и его таргетное торможение представляет логическую альтернативную стратегию терапии.

NF-κB и остеоартроз. Безусловно, ОА является воспалительным процессом, о чем свидетельствуют гиперплазия синовиального выстилающего слоя, усиление ангиогенеза, увеличение экспрессии провоспалительных цитокинов, С-реактивного протеина и др. [1, 6, 41]. Выраженность синовита коррелирует с прогрессированием ОА. Ключевым фактором в регуляции воспалительного процесса является NF-κB. С этих позиций принципиальной задачей терапии ОА является препятствование активации синтеза провоспалительных и деструктивных медиаторов, опосредованной компонентами фактора транскрипции NF-κB.

Сигнальный путь NF-κB задействован в критических событиях воспалительного ответа хондроцитов, приводящих к прогрессирующему повреждению экстрацеллюлярного матрикса и хрящевой деструкции. Так, экспериментальные исследования J.A. Roman-Blas and S.A. Jimenez (2006) продемонстрировали мощную активацию NF-κB в суставных хондроцитах после стимуляции культуры провоспалительными цитокинами IL-1β и TNF-α, играющими важную роль в катаболизме суставного хряща. Кроме того, исследования показали, что костимуляция как IL-1β, так и TNF-α вызывает синергетическое потенцирование активации NF-κB в хондроцитах.

Влияние NF-κB на функции суставных хондроцитов изучено в многочисленных исследованиях. Так, в прехондроцитах и хондроцитах крыс NF-κB и ERK1/2, представители MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase – митоген-активируемые протеинкиназы), выступают посредниками в ингибировании синтеза коллагена ІІ типа и связаны с экспрессией гена TNF-α [31, 45]. Исследования, проведенные на культуре человеческих хондроцитов остеоартрозного хряща и клетках хондросаркомы, продемонстрировали, что NF-κB, так же как MAPK, являются медиаторами экпрессии MMP-1, MMP-3, MMP-13, индуцированных IL-1β и TNF-α. Эти результаты, достигнутые с использованием различных специфических ингибиторов NF-κB и MAPK-сигнальных путей, позволяют предположить, что дальнейшее ингибирование IL-1β и TNF-α может быть потенциальной терапевтической стратегией предупреждения разрушения суставного хряща MMP [52].

Было также показано, что NF-κB является посредником повышенной экспрессии провоспалительных цитокинов, хемокинов, ростозависимых онкогенов GRO-α, GRO-β, GRO-γ и MMP-13 в культуре человеческих хондроцитов [18, 39]. Кроме того, продуцирование NF-κB повышается в культуре IL-1β-стимулированных донорских человеческих хондроцитов [18]. Наконец, исследования, выполненные на культуре бычьих хондроцитов, выращенных в условиях гипоксии и нормотоксии, показали более высокую концентрацию NF-κB и более высокую скорость связывания с ДНК у хондроцитов в условиях гипоксии [36].

Хорошо известно, что сигнальный путь NF-κB зависит от механических стимулов, влияющих на регуляцию транскрипции провоспалительных генов, задействованных в катаболических процессах в хондроцитах. Механические напряжения низкой интенсивности предотвращают ядерную транслокацию NF-κB, приводя к сдерживанию провоспалительной экспрессии генов. В отличие от этого, механические напряжения высокой интенсивности вызывают эту транслокацию, способствуя активации провоспалительных генов [8]. Исследования, выполненные на изолированных хондроцитах кролика, доказали, что циклическое равноосное напряжение низкой интенсивности ингибирует IL-1β-зависимую ядерную транслокацию NF-κB, тогда как высокоинтенсивное напряжение вызывает быструю ядерную транслокацию NF-κB (субъединиц р65 и р50), аналогичную таковой при действии IL-1β [7].

С другой стороны, учитывая провоспалительные эффекты NF-κB, было высказано предположение, что NF-κB может играть существенную роль в процессах апоптоза хондроцитов. При определенных условиях NF-κB проявляет эффекты, способствующие выживанию клеток суставного хряща. Поэтому в хондроцитах человека NF-κB частично опосредует антиапоптический эффект IL-1β в отношении рецептора CD-95 (FAS/APO-1) [27]. Дальнейшие эксперименты раскрыли NF-κB-зависимые механизмы защиты от CD95-индуцированного апоптоза. Они включают активацию каспазы-3 через регуляцию цитозольной концентрации XIAP-156 (X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein – Х-связанный протеин, ингибирующий апоптоз). Подавление функционирования протеосом и синтеза РНК NF-κB делает хондроциты человека чувствительными к NO-индуцированному апоптозу [25, 40].

С другой стороны, описано участие NF-κB в апоптозе суставных хондроцитов. Сигнальные пути, вовлеченные в этот процесс, являются достаточно сложными и окончательно не расшифрованы [42]. Этот путь включает активацию р38 оксидом азота. Активированный p38, в свою очередь, ингибирует киназу протеинкиназы Сζ. Сдерживание активности протеинкиназы Сζ приводит к активации NF-κB, который впоследствии активирует каспаза-3-индуцированный апоптоз через активацию р53 [26].

Таким образом, NF-κB играет важную роль в патогенезе ОА, приводя к повреждению суставных структур. Хрящевая и синовиальная ткань богата как NF-κB, так и IKK, являющейся ключевым ферментом в активации «канонического» NF-κB сигнального пути.

NF-κB и спондилоартрит. В нескольких исследованиях непосредственно изучалась роль активации NF-κB при СпА. Первоначально считалось, что активация NF-κB опосредована исключительно p50/p50 гомодимерами в синовиальных Т-клетках у пациентов с реактивным артритом и анкилозирующим СпА, в отличие от преобладания p50/p65 гетеродимеров в синовиальных Т-клетках при РА [14]. Другое недавнее исследование показало, что содержание ДНК-связывающей субъединицы p65 было снижено в ходе терапии инфликсимабом, в то время как уровень ДНК-связывающей субъединицы p50 оставался повышенным в лимфоцитах пациентов со СпА [16]. Изучение дифференцированной активации p50 и p65 в различных ситуациях может дать ответ относительно роли NF-κB в патогенезе СпА и эффективности антиTNF-α терапии. Особый интерес вызывают полученные данные о роли NF-κB в прогрессировании псориатического артрита, согласно которым клетки, экспрессирующие активный NF-κB р65, в основном локализованы в выстилающем слое и среди периваскулярных макрофагов синовиальной оболочки. Экспрессия NF-κB р65 в макрофагах была выражена в одинаковой степени при псориатичесом артрите и при РА, однако в выстилающих клетках была ниже при псориатическом артрите. Интересно, что после 6 месяцев терапии этанерцептом выраженность фосфорилирования IκBα в синовиальной оболочке значительно снизилась [32].

NF-κB как терапевтическая мишень. Учитывая важную роль NF-κB сигнального пути в деградации суставного хряща и прогрессировании ОА, были пересмотрены механизмы действия известных противоревматических препаратов относительно их гипотетического влияния на NF-κB. Большие усилия были приложены к изучению модуляции путей сигнала NF-κB фармакологическими средствами. Оказалось, что многие давно применяемые средства, включая нестероидные противовоспалительные препараты и кортикостероиды, влияют на NF-κB. Подавление активности NF-κB может являться основой механизма действия некоторых структурно-модифицирующих средств [43]. В настоящее время разрабатываются молекулы, способные влиять на отдельные белки в сложном сигнальном каскаде с участием NF-κB, а также стратегии с антисенсной ДНК-терапией и влиянием на РНК; в этом направлении уже достигнуты определенные успехи. Однако следует понимать, что NF-κB играет очень важную физиологическую роль и попытки ингибировать данный фактор сопряжены с массой проблем, приводящих к многочисленным опасным побочным эффектам. Разработка селективных модуляторов NF-κB является отдаленной перспективой для лечения ОА и РА [41].

Одними из наиболее известных ингибиторов NF-κB являются глюкокортикоиды [44]. Они индуцируют экспрессию IκB, связывающих NF-κB, повышая его цитозольную концентрацию [9, 44]. Глюкокортикоиды также способны инактивировать NF-κB-ДНК-связывающую активность путем прямого взаимодействия между глюкокортикоидными рецепторами и участками связывания NF-κB в промоторах различных генов [15]. Активированный глюкокортикоидный рецептор также может взаимодействовать с NF-κB путем прямого связывания по типу белок-белок, предотвращая активацию NF-κB в некоторых клетках. Наконец, между глюкокортикоидными рецепторами и NF-κB возможны и конкурентные отношения вследствие ограниченного количества коактиваторов CREB-связывающего белка (cAMP response element-binding protein, транскрипционный фактор) и стероидных рецепторов коактиватора-1 [46]. Однако использование глюкокортикоидов при ОА ограничено только случаями активного синовита.

Еще одной известной группой препаратов, влияющих на активность NF-κB, являются нестероидные противовоспалительные средства, такие как аспирин, салицилаты, ибупрофен, сулиндак и др. Они способны ингибировать IKK, предотвращая IκB фосфорилирование и таким образом блокируя путь активации NF-κB [47]. Сульфасалазин также подавляет IκB фосфорилирование, с чем частично связаны его противовоспалительные свойства. Такие иммуносупрессоры, как циклоспорин А и такролимус, также подавляют сигнальный путь NF-κB. Как ингибиторы NF-κB описаны витамины С и Е [13], куркурмин, флавоноиды [12], талидомид [37], лактацистин, лефлунамид [34], диацереин и другие препараты.

В последнее время активно развиваются новые терапевтические методики, направленные на ингибирование ключевых элементов NF-κB сигнального пути, что позволяет оптимистически смотреть на разработку эффективных стратегий лечения ОА. В этом смысле особый интерес представляют современные хондропротективные препараты – хондроитина сульфат и глюкозамина сульфат, обладающие прямым воздействием на NF-κB [6].

Хондроитина сульфат – структурный модулятор, который не только синтезируется организмом, но также после введения в организм интегрируется в структуры хрящевой ткани, стимулируя ее синтез и тормозя деструкцию. Его своевременное и регулярное назначение обеспечивает ингибирование, cтабилизацию и профилактику развития деструктивных процессов в суставе [5]. Биологическая активность хондроитина сульфата была подтверждена в отношении воздействия на NF-κB, уменьшения экспрессии IL-1β хондроцитами и синовиоцитами, а также снижения концентрации С-реактивного протеина, ингибиции экспрессии циклооксигеназы-2 [38]. Фармакопротеомические исследования позволили выявить, что в культуре кроличьих хондроцитов хондроитина сульфат ограничивает перемещение ядерного фактора транскрипции NF-κB в ядро, снижает фосфорилирование экстрацеллюлярной сигнал-регулируемой киназы (ERK1/2) и митогенактивированной протеинкиназы (p38MAPK) в ответ на стимуляцию IL-1β.

При наличии фоновой патологии хондроитина сульфат оказывает системное положительное действие, так как он способен снижать активацию NF-κB не только в хрящевой ткани. Так, было продемонстрировано, что хондроитина сульфат снижает активность NF-κB в гепатоцитах при гепатите. Известно также, что прогрессирование атеросклеротического процесса также опосредуется через сигнальный путь NF-κB, что объясняет замедление прогрессирования атеросклероза под влиянием хондроитина сульфата.

Особый клинический интерес представляют экспериментальные данные (метод флуоресценции) об ингибировании NF-κB в гепатоцитах при использовании хондроитина сульфата [28]. Поэтому были высказаны предположения, что хондроитина сульфат может использоваться и при других заболеваниях, поскольку:

• в хряще некоторые эффекты хондроитина сульфата могут быть связаны с ингибированием фактора ядерной транслокации NF-κB;
• в синовиальной мембране подавление отека и эффузии хондроитина сульфата может быть связано с ингибированием ядерной транслокации NF-κB;
• in vivо хондроитина сульфат предупреждает ядерную транслокацию NF-κB в гепатоцитах;
• эти исследования подтверждают гипотезу о том, что хондроитина сульфат может редуцировать активацию NF-κB и в других тканях.

Среди болезней человека, связанных с активацией NF-κB, наибольшее внимание привлекают болезнь Альцгеймера, атеросклероз, болезнь Паркинсона и кожный псориаз. В прошлом году были опубликованы данные об эффектах хондроитина сульфата в эксперименте на кроликах с артритом и нарастанием сосудистой патологии вследствие атеросклероза [29]: хондроитина сульфат снижал уровень маркеров системного воспаления (IL-6 и С-реактивного протеина), приводил к отчетливому улучшению проявлений атеросклероза при рестенозе бедренной артерии и уменьшал проявления атеросклероза в аорте. Поэтому данные, подтверждающие возможности хондроитина сульфата оказывать дополнительное положительное влияние на течение иных, кроме ОА, хронических заболеваний представляют явный интерес для клиницистов.

Глюкозамина сульфат является компонентом суставного хряща. In vitro показано, что данное вещество, добавленное к культуре хондроцитов, стимулирует синтез протеогликанов. Глюкозамина сульфат является субстратом синтеза протеогликанов хондроцитами, участвует в синтезе глюкуроновой кислоты (вещества, обеспечивающего вязкость внутрисуставной жидкости), а также подавляет активность MMP (коллагеназы, фосфолипазы) [2, 6]. Известно, что глюкозамина сульфат предотвращает распад IκB, ограничивает перемещение NF-κB в ядро и снижает выработку провоспалительных факторов в ответ на соответствующие стимулы, такие как действие IL-1β [20].

Хондроитина сульфат и глюкозамина сульфат также уменьшают резорбцию субхондральной кости. Первый повышает активность остеопротегерина, который блокирует дифференцировку остеокластов и снижает экспрессию гена RANKL (лиганда рецептора активатора NF-κB), а второй оказывает влияние на резорбцию кости через RANKL-независимый механизм.

Достижения в изучении патогенеза ОА дают надежду на обнаружение мишеней для новых лекарственных средств, которые будут способны значительно замедлить прогрессирование болезни. Одним из таких достижений можно считать обнаружение того факта, что ОА может протекать как с выраженным воспалительным компонентом, зависимым от IL-1 и активации фактора транскрипции NF-kB, так и без воспаления и активации соответствующих факторов транскрипции. В первом случае достаточно эффективными в лечении оказываются средства, блокирующие NF-κB, такие как хондроитина сульфат и глюкозамина сульфат, а во втором значительного эффекта от подобных средств ожидать не приходится [11].

Список литературы находится в редакции