Фармакологічна корекція композицією вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та мікроелементного комплексу Есмін прогресування експериментального цирозу печінки на фоні гіпергомоцистеїнемії

Відомо, що індивідуальні темпи формування цирозу печінки та прояви його ускладнень суттєво різняться, а провідним чинником, який визначає прогноз хронічного захворювання печінки, є швидкість прогресування фіброзу печінки. Це спонукає до пошуку факторів, які прискорюють чи гальмують печінковий фіброгенез. Нещодавно показано, що навантаження гомоцистеїном (ГЦ) здатне індукувати фіброз печінки у щурів і посилювати процеси фіброзування, викликані введенням чотирихлористого вуглецю (ССl₄) (Пентюк, 2009). З іншого боку, нами встановлено, що й формування ССl₄-індукованого фіброзу печінки супроводжується розвитком гіпергомоцистеїнемії (ГГЦ) (Н.О. Пентюк, 2009). Не виключено, що ГГЦ може впливати на темпи формування портальної гіпертензії та її ускладнень. Розвиток гепаторенального, гепатопульмонарного синдромів, ентеропатії та енцефалопатії значною мірою зумовлений порушеннями мезентеріальної та системної гемодинаміки. Оскільки надлишок ГЦ виявляє токсичну дію щодо ендотелію судин, не виключено, що ГГЦ буде прискорювати декомпенсацію цирозу. Однак ця гіпотеза потребує експериментальних та клінічних доказів.

У лабораторії кафедри біохімії та загальної хімії ВНМУ імені М.І. Пирогова показано, що високі дози вітамінів В₆, В₉ та В₁₂, а також вітамінно-мінеральний комплекс (ВМК), до складу якого входять, крім вказаних вітамінів, мікроелементи цинк, хром та ванадій, мають гіпогомоцистеїнемічну дію, а також здатність профілактувати та лікувати ускладнення, викликані ГГЦ (М.А. Артемчук, 2008). Із зазначених мікроелементів Zn напряму задіяний у метаболізмі метіоніну та ГЦ: ензими, які метилюють ГЦ (метіонінсинтетаза [J.L. Ferrer et al., 2004, M. Koutmos et al., 2008] та бетаїнгомоцистеїнметилтрансфераза [N.S. Millian, T.A. Garrow, 1998]), є Zn-вмісними металоензимами. Недостатність хрому підсилює ризик виникнення серцево-судинної патології. Відомо також, що ванадій має антидіабетичну дію, а у хворих на цукровий діабет часто трапляються випадки ГГЦ.

Мета роботи

Метою дослідження стало вивчення патогенетичного зв’язку між ГГЦ та ССl₄-індукованим цирозом печінки та його ускладненнями (ентеропатія, енцефалопатія, ниркова та легенева дисфункція), а також оцінка здатності речовин з гіпогомоцистеїнемічною дією (вітаміни В₆, В₉ та В₁₂) та полімікроелементного комплексу Есмін запобігати цим процесам.

Матеріали і методи

Дослідження проведено на 36 дорослих (вага 200-250 г) самцях білих щурів, які знаходились на звичайному раціоні віварію та мали вільний доступ до питної води. Тварин було розподілено на 4 групи по 7-10 щурів в кожній. Перша група – контроль. У тварин другої групи було створено класичну, індуковану введенням CCl₄, модель цирозу печінки. Чотирихлористий вуглець уводили тваринам перорально у вигляді 40% розчину на соняшниковій олії 2 рази на тиждень по 0,3 мл на 100 г маси тіла протягом 6 тижнів. Тваринам третьої групи, крім CCl₄, вводили тіолактон ГЦ – по 100 мг/кг маси тіла 4 дні на тиждень протягом 6 тижнів (Н.О. Пентюк, 2009). Нагадаємо, що за ГГЦ завжди утворюється в певній кількості тіолактон ГЦ, який є більш токсичною формою порівняно з ГЦ, і тому тіолактонова модель ГГЦ широко використовується в експериментальній практиці. Четверта група, крім CCl₄ і тіолактону ГЦ, отримувала щодня інтрагастрально на крохмальному клейстері суміш вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та Есмін. Вітаміни вводили з розрахунку 0,714 мг вітаміну В₆, 0,143 мг вітаміну В₉, 0,0143 мг вітаміну В₁₂ на 1 кг маси тіла. Вказані дози вітамінів у 7-15 разів перевищують добову потребу і забезпечують стабільний гіпогомоцистеїнемічний ефект (О.О. Пентюк та ін., 2004). Тваринам контрольної групи двічі на тиждень вводили у вищевказаній дозі інтрагастрально олію, а щодня – крохмальний клейстер.

Вибір Есміну (Реєстраційне посвідчення МОЗ України № UA/0446/01/01/) як джерела мікроелементів зумовлений трьома причинами. По-перше, до його складу, крім цинку, хрому та ванадію, входять інші важливі для багатьох метаболічних процесів мікронутрієнти. Склад однієї капсули Есміну: заліза (ІІІ) – 3,0 мг; цинку (ІІ) – 4,0 мг; марганцю (ІІ) – 0,8 мг; міді (ІІ) – 0,7 мг; кобальту (ІІ) – 0,07 мг; хрому (ІІІ) – 0,07 мг; селену (ІV) – 0,05 мг; молібдену (VІ) – 0,07 мг; ванадію (V) – 0,01 мг, мефенамінової кислоти – 85 мг (Есмін; Компендіум 2006). По-друге, згідно з інструкцією, Есмін має антиоксидантні властивості, а саме оксидативний стрес є однією з причин цитотоксичної дії ГГЦ. По-третє, до складу Есміну, що принципово важливо, входить мефенамінова кислота. На основі цієї сполуки (N-2,3-диметилфенілантранілової кислоти) в інституті фармакології та токсикології НАМН України були синтезовані координаційні сполуки з біоелементами (вони входять до складу Есміну), що забезпечує виняткову фармакологічну активність при суттєвому зниженні їх токсичності.

Розрахунок дозування Есміну: згідно з інструкцією, дорослим Есмін призначається по 1-2 капсули на добу. Вважаємо, що Есмін призначається по 2 капсули на 70 кг маси тіла (1 капсула на 35 кг маси тіла). Для щурів доза у 5 разів вища (М.А. Артемчук, 2008), тобто 5 капсул на 35 кг маси тіла = 1 капсула на 7 кг маси тіла = 1/7 капсули на 1 кг маси тіла щура = 1/70 капсули на 100 г маси щура). Процедура: 1 капсулу Есміну ex tempore ретельно змішували в ступці з 70 мл 1% крохмального клейстеру та вводили інтрагастрально по 1 мл на 100 г маси тіла щура. У цю ж суміш перед вжитком вносили розраховану кількість вітамінів В₆, В₉ та В₁₂.

З досліду тварин виводили шляхом декапітації під легким ефірним наркозом. Досліди виконували згідно з правилами гуманного відношення до експериментальних тварин, затверджених комітетом з біоетики ВНМУ.

Як маркери активації фіброгенезу та колагеноутворення визначали вміст трансформуючого фактора росту β1 (ТФР-β1) методом імуноферментного аналізу (набір виробництва ALPCO Diagnostics, США), вміст ретинолу та його похідних у печінці, активність сироваткової параоксонази-арилестерази (шифр за класифікацією ферментів [КФ] 3.1.1.2), вміст гідроксипроліну в печінці, гіалуронату в сироватці крові та гістологічну стадію фіброзу в балах (від 1 до 4) (C. Raetsch et al., 2002). Вміст ГЦ в сироватці крові визначали методом імуноферментного аналізу (набір виробництва Axis-Shield, Великобританія), вміст гідрогену сульфіду (H2S) – за допомогою адаптованого авторами методу (Н.В. Заїчко та ін., 2009). У постмітохондріальній фракції гомогенату печінки визначали активність ферментів обміну ГЦ: цистатіонін-β-синтази (КФ 4.2.1.22), цистатіонін-γ-ліази (КФ 4.4.1.1), цистеїнамінотрансферази (КФ 2.6.1.3), тіосульфатдитіолсульфуртрансферази (КФ 2.8.1.5), S-аденозилгомоцистеїнгідролази (КФ 3.3.1.1), бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази (КФ 2.1.1.5), S-аденозилметіонінсинтетази (КФ 2.5.1.6) (M.H. Stipanuk, P.W. Beck, 1982; Y. Isa et al., 2006). У ліпідному екстракті печінки визначали загальний вміст фосфоліпідів та їх фракційний склад (О.О. Пентюк та ін., 1987). Проникність стінки кишечника оцінювали за 8-годинною екскрецією з сечею перорально введеної сахарози (N.M. Davies et al., 1995). У гомогенатах слизової оболонки кишечника визначали вміст глікозаміногліканів (за їх компонентом гексозаміном [J. Ludowieg, J.D. Benmaman, 1967]), активність мієлопероксидази (КФ 1.11.1.7) (D.R. Nemzek et al., 2000) та вміст малонового діальдегіду. За допомогою бронхоальвеолярного лаважу визначали активність ферментів γ-глутамілтрансферази (КФ 2.3.2.2) та глутатіон-S-трансферази (КФ 2.5.1.18) (W.H. Habig, W.B. Jacobi, 1981). У головному мозку щурів визначали вміст води методом висушування, а також вміст аміаку, глутаміну (А.И. Силакова, Н.П. Корнюшенко, 1969), глутамату та гліцину (Л.Д. Попова, 2007). Фіксували також наявність або відсутність асцитичної рідини та її об’єм, вагу селезінки та клубочкову фільтрацію (за кліренсом креатиніну).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою комп’ютерної програми «MS Excel XP».

Результати та обговорення

Шеститижневе введення CCl4 закономірно спричиняє фіброз печінки у щурів, про що свідчить зростання рівнів ТФР-β1 та гіалуронату в сироватці крові, вмісту гідроксипроліну в печінці, зменшення вмісту ретиноїдів у печінці та зменшення активності сироваткової параоксонази (табл. 1). Середня стадія фіброзу печінки в цій групі становила 3,22 ± 0,15 бала. Додаткове навантаження тіолактоном ГЦ значно посилило процеси фіброзування в печінці, що проявлялося вірогідними змінами вказаних показників, зокрема гістологічна стадія фіброзу досягла 3,85 ± 0,07 бала. Наявність важкої спленомегалії і асциту свідчить про те, що у переважної більшості тварин цієї групи фіброз досягнув своєї термінальної стадії – цирозу печінки з явищами портальної гіпертензії. Застосування комплексу вітамінів та Есміну привело до помітної редукції печінкового фіброгенезу; зокрема, вміст ТФР-β1 та гіалуронату в сироватці крові, гідроксипроліну в печінці, частота асциту були навіть меншими, ніж у тварин з моделлю CCl₄-індукованого фіброзу печінки.

Як видно з таблиці 2, ГГЦ значно обтяжувала органну дисфункцію при експериментальному фіброзі печінки. Вірогідно зменшились клубочкова фільтрація і натрійурез, що є ознакою поглиблення ниркової недостатності. Вірогідно зросла проникність кишечника для сахарози, активність мієлопероксидази кишечника та печінки, що є ознакою посилення мікробної транслокації через стінку кишки. Зростання вмісту малонового діальдегіду та зменшення вмісту глікозаміногліканів слизової оболонки кишечника свідчить про посилення ентеропатії. Проведення бронхоальвеолярного лаважу показало вірогідне збільшення активності γ-глутамілтрансферази та глутатіон-S-трансферази. Посилювались також явища печінкової енцефалопатії: зростав уміст в мозку води, аміаку та його транспортної форми – глутаміну, гальмівного медіатора гліцину; знижувався уміст глутамату. Додаткове введення вітамінів та Есміну привело до суттєвого поліпшення ниркової функції, зменшення проявів ентеропатії, легеневої дисфункції та енцефалопатії.

Дані, наведені в таблиці 3, свідчать, що навіть при формуванні класичного CCl₄-індукованого фіброзу печінки у щурів розвивається ГГЦ, яка закономірно посилюється при додатковому введенні тіолактону ГЦ. Крім того, при CCl4-індукованому фіброзі печінки спостерігалось значне зростання вмісту в сироватці крові гідрогену сульфіду, який, як нещодавно було показано, є потужним вазодилятатором. Причиною цього є зростання активності основних ферментів, що його продукують – цистатіонін-β-ліази та цистатіонін-β-синтази в печінці, а також тенденція до підвищення активності цистеїнамінотрансферази. Формування CCl₄-індукованого фіброзу супроводжувалось виразним пригніченням процесів метилювання в печінці, що проявляється зростанням рівня фосфатидилетаноламіну при зменшенні частки фосфатидилхоліну та зниженням активності основних ферментів метилювання бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази та S-аденозилметіонінсинтази. Водночас активність S-аденозилгомоцистеїнгідролази суттєво зростала. ГГЦ значно поглиблювала порушення процесів транссульфування та трансметилювання у тварин з CCl₄-індукованим фіброзом. Вітаміни В₆, В₉, В₁₂ та Есмін мали значну гіпогомоцистеїнемічну дію та суттєво протидіяли порушенню процесів транссульфування та трансметилювання в печінці.

Таким чином, отримані нами дані свідчать, що хронічна ГГЦ значно посилює фіброгенну дію CCl₄, що підтверджується більш глибокими змінами маркерів фіброгенезу: концентрації ТФР-β1, гіалуронату, параоксонази сироватки крові, гідроксипроліну та ретиноїдів у печінці. У більшості тварин, що отримували CCl₄ в поєднанні з ГЦ, формування фіброзу досягло своєї термінальної стадії – цирозу печінки з явищами портальної гіпертензії (спленомегалія, асцит). За умов ГГЦ прояви органної дисфункції були виразнішими порівняно з тваринами, що отримували лише CCl₄. У них більшою мірою страждала функція нирок (інтенсивніше знижувалася швидкість клубочкової фільтрації та натрійурезу); посилювались явища ентеропатії та бактеріальної транслокації (зростала проникність кишечника для саха Примітки: * вірогідна різниця стосовно групи «інтактний контроль»; **, , В#946;1 (ТФР-sub/tdffedde2,07 ± 0,21В#946;1 (ТФР-ffeddecenterbrtd bgcolor= вірогідн, В#946;1 (ТФР-subffeddecaptionа різниця стосовно групи «CClbrрози, знижувався рівень глікозаміногліканів та зростав вміст малонового діальдегіду в слизовій оболонці, підвищувалась активність мієлопероксидази в слизовій кишечника та печінці); посилювалося ураження легень (при проведенні бронхоальвеолярного лаважу зростав вихід у рідину ферментів γ-глутамілтрансферази та глутатіон-S-трансферази) та мозку (зростав уміст в мозку води, аміаку, глутаміну та гліцину при зменшенні вмісту глутамату). Здатність ГГЦ прискорювати розвиток органних ускладнень підтверджує і наявність вірогідних кореляційних зв’язків між рівнем ГЦ у сироватці крові та маркерами ураження органів.

Отримані нами дані дають змогу висунути декілька гіпотез щодо механізмів промотуючої дії ГГЦ на формування ускладнень цирозу печінки. По-перше, прискорення декомпенсації цирозу можна пояснити наявністю у ГЦ суттєвої профіброгенної дії; саме завдяки прискоренню фібротичних процесів швидше розвивається цироз печінки і настає його декомпенсація. По-друге, ми показали, що тяжкість органних уражень тісно корелює зі зростанням вмісту гідрогену сульфіду в крові та посиленням активності цистатіонін-β-синтази, цистатіонін-γ-ліази в печінці – ферментів, що продукують гідрогену сульфід з цистеїну та частково з ГЦ. Відомо, що H2S є потужним вазодилятатором судин різних органів, включаючи печінку та мезентеріальні судини (S. Fiorucci, et al., 2006). Варто зазначити, що на етапі формування фіброзу, ще до появи ознак сформованого цирозу печінки, має місце не зростання вмісту гідрогену сульфіду в крові тварин, а навпаки – зниження. Очевидно, підвищення вмісту гідрогену сульфіду і знаменує настання декомпенсованих форм цирозу. Ми вважаємо, що однією з причин стимулювання синтезу H2S при цирозі є транслокація бактеріальних токсинів з кишечника в портальну систему, адже мікробні ліпополісахариди є потужними активаторами цистатіонін-γ-ліази, цистатіонін-β-синтази, синтази оксиду азоту та гемоксигенази (X.H. Zhou et al., 2009; N. Grion et al., 2007), тобто ферментів, що продукують вазодилятатори H2S, NO, CO. Очевидно, має місце певна послідовність взаємопов’язаних і взаємообтяжливих подій, які в кінцевому підсумку ведуть до утворення патологічного кола. На певній стадії фіброзу виникає утруднення кровотоку через фіброзно змінену печінку, що веде до формування ентеропатії, портальної гіпертензії (M.A. Aller еt al., 2007). Патогенез останньої пов’язаний із зростанням венозного тиску в мезентеріальних судинах, набряком та погіршенням кровопостачання слизової оболонки, її ішемічним пошкодженням. Наслідком цього є порушення цілісності кишкового бар’єра та потрапляння в системний кровотік мікроорганізмів, токсини яких і стимулюють гіперпродукування вазодилятаторів. У подальшому посилене продукування вазодилятаторів ще більше поглиблює застій в мезентеріальному басейні, ентеропатію та мікробну транслокацію. Події, які первинно розпочинаються в спланхнічному басейні, рано чи пізно призводять і до порушень системної гемодинаміки, зокрема розвитку системної вазодилятації. Виразна дилятація легеневих судин спричиняє порушення вентиляційно-перфузійних процесів, легеневу недостатність і гепатопульмонарний синдром. Гепаторенальний синдром розвивається внаслідок компенсаторного посилення синтезу вазоконстрикторів, що лише частково компенсує зміни в мезентеріальному басейні, проте спричиняє судинну констрикцію в нирках та їх дисфункцію. Вазодилятація та зростання проникності гематоенцефалічного бар’єра стають основою для проникнення в мозок токсичних субстанцій, які викликають розвиток печінкової енцефалопатії (A.G. Sarishvili et al., 2007). Патогенетична роль гідрогену сульфіду в розвитку енцефалопатії, на нашу думку, не обмежується лише його вазодилятувальною дією. Відомо, що гідрогену сульфід є нейромодулятором і у високих концентраціях може чинити нейротоксичну дію (M.F. Struve, et al., 2001; H. Kimura, 2002].

Третім можливим механізмом промотуючої дії ГГЦ на формування органних уражень при цирозі печінки є порушення процесів метилювання. Реакції метилювання необхідні для синтезу фосфоліпідів, креатину, обміну катехоламінів та нейромедіаторів і здійснення інших численних процесів. Метилювання нуклеїнових кислот та білків є ключовим процесом епігенетичної регуляції активності генів та регуляції активності білків, включаючи й ті, що мають відношення до процесів фіброгенезу. Отримані нами дані свідчать, що при поєднаному застосуванні CCl₄ та ГЦ процеси метилювання суттєво гальмуються, про що свідчить зростання рівня фосфатидилетаноламіну при зменшенні частки фосфатидилхоліну (останній є продуктом метилювання фосфатидилетаноламіну). Активність S-аденозилметіонінсинтази, яка синтезує кофермент метилювання, за цих умов знижується. Активність бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, яка утилізує надлишок ГЦ, перетворюючи його на метіонін, також знижується. Водночас активність S-аденозилгомоцистеїнгідролази, яка каталізує утворення ГЦ, навпаки, зростає, а ГЦ є потужним інгібітором процесів метилювання (О.О. Пентюк та ін., 2003).

Варто зауважити, що описані закономірності мають місце не лише при цирозі, який моделюється поєднаним уведенням ССl₄ та ГЦ, але й при ізольованому введенні ССl4. Крім того, при ССl₄-індукованому фіброзі рівень ГЦ в крові зростає і без його додаткового введення, так само підвищується вміст гідрогену сульфіду, посилюється активність ферментів транссульфування при пригніченні процесів метилювання. Масштаби цих змін були дещо меншими, ніж за умов ГГЦ, але й цироз печінки при застосуванні цієї моделі не досягав такої міри тяжкості. Ці дані дають змогу припускати, що ГГЦ та пов’язані з нею порушення процесів транссульфування і трансметилювання є обов’язковим елементом патогенезу цирозу печінки будь-якого походження. Патогенетична значущість порушень обміну ГЦ підтверджується й тим, що застосування вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та мікроелементного комплексу Есмін, які мали виразну гіпогомоцистеїнемічну дію, дало можливість суттєво загальмувати розвиток цирозу печінки та його ускладнень.

Таким чином, отримані дані засвідчили тісний зв’язок між гіпергомоцистеїнемією та прогресуванням цирозу печінки і його ускладнень. Можна очікувати, що контроль за рівнем гомоцистеїну в сироватці крові хворих на цироз печінки та корекція гіпергомоцистеїнемії дадуть змогу уповільнити декомпенсацію цирозу печінки. Одним із маркерів загрози декомпенсації може бути підвищений рівень гідрогену сульфіду в сироватці крові.

Крім того, вважаємо доцільним проведення серії робіт у галузі експериментальної і клінічної гепатології в напрямку вивчення профілактичної та лікувальної дії препарату Есмін в поєднанні з вітамінами В₆, В₉, В₁₂.

Список літератури знаходиться в редакції