Роль оксиду нітрогену в регуляції судинного тонусу в легеневому руслі

Низький опір в легеневому судинному руслі встановлюється при народженні людини і модулюється балансом вазоконстрикторів та вазодилататорів, які синтезуються легеневим ендотелієм (H.W. Farber, J. Loscalzo, 2004). Особливістю легеневих судин є реакція звуження у відповідь на гостру гіпоксію, тоді як судини системного русла на цей подразник відповідають периферичною вазодилатацією. Така фізіологічна реакція легеневих судин є критичною щодо механізмів вентиляції та перфузії. Дисбаланс вазорегулюючих активних субстанцій внаслідок тривалої гіпоксії або ендотеліальної дисфункції може призвести до легеневої вазоконстрикції, проліферації судинних гладеньком’язових клітин, місцевого тромбозу, що в результаті зумовлює розвиток легеневої гіпертензії.

Оксид нітрогену (NO), головний фактор регуляції судинного тонусу, є вільним радикальним газом, який дифундує з місця свого синтезу в ендотеліальних клітинах до своєї мішені – розчинної гуанілатциклази (рГЦ) в судинних гладеньком’язових клітинах. У такому класичному механізмі дії NО активація рГЦ підсилює продукцію циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ), що викликає вазодилатацію. Альтернативним шляхом дії NО вважається його окиснення до нітритів (D.B. Kim-Shapiro, A.N. Schlechter, M.T. Gladwin, 2006) або реакції NО з білками тіолів з утворенням активних вазодилатувальних нітрозотіольних сполук (D.T. Hess et al., 2005). Цікавим та інтригуючим є той факт, що нітрит та нітрозотіоли взаємодіють з гемоглобіном, використовуючи його алостеричну природу всередині еритроцитів, та транспортують молекулу NO на периферію, де судинорозширювальний потенціал використовується для доставки оксигенованої крові до гіпоксичних тканин.

Відкриття синтезу NО в клітинах ссавців та його ролі в розширенні кровоносних судин стало найбільш неочікуваним та парадоксальним відкриттям в біології та медицині, і 1998 року це було відзначено Нобелівською премією. Роль NО в підтриманні гомеостазу в легеневих судинах та в розвитку серцево-легеневої патології була встановлена на моделях легеневих ушкоджень та гіпертензії в малому колі кровообігу в генетично модифікованих мишей (I.N. Mungrue et al., 2003).

Регуляція синтезу NO

Біосинтез молекули NО в організмі відбувається при окисненні аргініну – природної амінокислоти, що входить до складу білків, – за допомогою ферментів з сімейства NО-синтаз (NОSs). Ізоформи NОS відрізняються між собою не лише за місцями їх найбільшої експресії, але й за регуляцією їх активності. Відомі 3 типи ізоферментів NОS: NОS3 (ендотеліальна), NОS2 (індуцибельна, або макрофагальна) та NОS1 (нейрональна). Початкові дослідження щодо вивчення ролі NО в легенево-судинній фізіології були основані на застосуванні NОS-інгібіторів. Повне розуміння значення кожної ізоформи NОS для розвитку судинної патології стало можливим після створення генетично модифікованих мишей з дефіцитом кожного типу NО-синтаз, приклади чого наведено нижче.

Домінуючим ферментом в синтезі NО в легеневому кровоносному руслі є ендотеліальна NО-синтаза (NОS3). NОS3 – це конституційний мембранозв’язувальний фермент, експресія якого відбувається в ендотеліальних клітинах судин і регулюється концентрацією іонів кальцію (Ю.И. Головченко, М.А. Трещинська, 2008; D.M. Dudzinski, J. Igarashi et al., 2006).

Нейрональна та індуцибельна NО-синтази в малих кількостях локалізуються на епітелії дихальних шляхів та в судинних гладеньком’язових клітинах. Основним джерелом індуцибельної NО-синтази (NОS2) є макрофаги (що і зумовило її другу назву – макрофагальна NО-синтаза). Активність індуцибельної форми NOS не залежить від внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію, що уможливлює гіперпродукцію NO до цитотоксичних рівнів, а це може мати велике патофізіологічне значення. Цікавим є той факт, що ендотоксини та прозапальні цитокіни можуть індукувати експресію NОS2 практично в усіх легеневих клітинах (А.Ф. Ванин, 2000).

NО-синтаза є активною лише у вигляді гомодимеру: кожна субодиниця складається з редуктазного та оксигеназного домену, розділених кальмодуліновим комплексом. Оксигеназний домен є активною ділянкою для синтезу NО і має сайти для зв’язування з гемом та L-аргініном. Перенос електрону з редуктазного домену призводить до активації молекулярного кисню зв’язаного із залізом гему. Другим кроком є окиснення гуанідин-нітрогенового комплексу L-аргініну, внаслідок чого утворюються оксид нітрогену та L-цитрулін. Надлишок синтезованого NО, за принципом зворотного зв’язку, інгібує активність NОS (M.P. Coggins, K.D. Bloch, 2007).

Виділяють два рівні секреції NО – базальна, яка підтримує фізіологічний тонус судин в спокої та забезпечує неадгезивність ендотелію до формених елементів крові, та стимульована – у відповідь на різноманітні стимули, такі як динамічне напруження м’язових волокон, циркулюючі гормони (норадреналін, вазопресин і брадикінін), різноманітні аутакоїди (ацетилхолін, гістамін, серотонін) і компоненти каскаду коагуляції (тромбін) (Ю.І. Головченко, М.А. Трещинська, 2008).

цГМФ-залежний механізм дії NO

Класичним сигнальним механізмом дії NO є вплив на рГЦ, яка є гетеродимером і має 2 субодиниці – α та β. Для серцево-судинної системи важливим є ізомер α1β1. Реакція оксиду нітрогену з рГЦ призводить до підвищеної продукції цГМФ (D.P. Ballou, Y. Zhao et al., 2002). У гладеньком’язових клітинах судин ефекти цГМФ опосередковуються через активацію специфічних білків – цГМФ-залежної протеїнкінази та цГМФ-пропускних іонних каналів, а також через регуляцію активності клітинних фосфодіестераз. Розслаблення гладеньких м’язових волокон може відбуватись декількома шляхами, включаючи гіперполяризацію клітинної мембрани та інгібіцію надлишкового входження кальцію в клітину. Деякі автори вважають, що цГМФ знижує чутливість міофіламентів до іонів кальцію (T. Munzel, R. Feil et al., 2003). рГЦ-залежний шлях обмежується швидким руйнуванням циклічного нуклеотиду фосфодіестеразами, серед яких особливе місце посідає фосфодіестераза 5-го типу, що в надлишковій кількості локалізується в легеневих судинах та міокарді правого шлуночка (S.D. Rybalkin, C. Yan et al., 2003). Після звільнення від зв’язку з гуанілатциклазою NO, перетворений на нітрит (NO₂), потрапляє в плазму і потім в еритроцити крові. У них нітрит перетворюється на нітрат (NO3) після реакції з гемоглобіном. Деяка частина оксиду нітрогену дифундує прямо в кровотік з ендотелію. NO негайно захоплюється та утримується еритроцитами та перетворюється на нітрат при додаванні кисню від оксигенованого гемоглобіну. Нітрат далі знову потрапляє в кров та екскретується нирками.

цГМФ-незалежний, альтернативний механізм дії NO

S-нітрозилювання може модулювати функції широкого спектру білків з високим ступенем субстратної специфічності (J.S. Stamler, S. Lamas, F.C. Fang, 2001; D.T. Hess et al., 2005). Наприклад, в ендотеліальних клітинах аорти великої рогатої худоби NOS₃ у спокої є нітрозильованою. Судинний ендотеліальний фактор росту викликає денітрозилювання молекули та її активацію з наступним поверненням ферменту до нітрозильованого стану в спокої. Крім того, джерелом NO-груп для реакцій S-нітрозилювання можуть бути нітрити, інші нітрозотіоли, NO-окиснені продукти або комплекси метал-NO. Всі ці стабільні сполуки здатні транспортувати сигнальну молекулу оксиду нітрогену на більш значні відстані, ніж вона могла би дифундувати як вільний газ із місця свого утворення.

NО, який утворюється з аргініну під дією NОS, є досить нестабільною молекулою (середній час життя NО в організмі людини становить менше 5 секунд), тому він може залучатись до безлічі хімічних реакцій: утворювати комплекс кисню з гемоглобіном (Hb-О₂) та іншими гемовмісними білками, де окиснюється до нітрату (NО3-); при взаємодії з супероксидним радикалом він утворює пероксинітрит (ООNО-); невеликі кількості оксиду нітрогену відновлюються до N₂О і навіть до амонію. NО також може окиснюватись до діоксиду NО₂, який може утворювати суміші інших оксидів нітрогену (ізомери N₂О3 та N₂О₄). Оскільки всі вищі оксиди нітрогену реакційно активні, то вони також вступають і в реакції S-нітрозування з тіольними білками з утворенням тіонітритів (нітрозотіольних сполук) та іонів нітриту (NО₂-); вони мають більш довгий період життя порівняно з вільною молекулою NO. Окиснення плазмового NO до нітриту каталізується ферментом церулоплазміном. Згодом нітрит може відновлюватись до NO при зниженні рН крові або за наявності відновлювального ферменту (D.B. Kim-Shapiro, A.N. Schlechter, M.T. Gladwin, 2006). Найкраще вивчені реакції нітрозилювання SH-груп залишків амінокислоти цистеїну, в результаті чого утворюються нітрозотіольні сполуки. Тривалість життя молекул нітрозотіолів залежно від радикалу становить десятки хвилин і навіть години (А.А. Недоспасов, Н.В. Беда, 2005). Оскільки молекула оксиду нітрогену є нестійкою, то основна маса NО, залученого до кругообігу, припадає не на NО, а на продукти його окиснення, які утворюють депо оксиду нітрогену в організмі людини.

Роль NO в фізіології легеневого судинного тонусу

Перші дослідження ролі NO в малому колі кровообігу були основані на використанні загальних інгібіторів NO-синтаз. З відкриттям ізоформ цих ферментів виник диференційований підхід до їх застосування та розуміння важливої ролі кожної з них у легеневій судинній біології. Наприклад, делеція гену NОS3 у дорослих мишей викликала системну гіпертензію та помірну легеневу гіпертензію без ознак ремоделювання легеневих судин (W. Steudel et al., 1997). Використовуючи ізольовану перфузію легеневого комплексу мишей з дефіцитом кожної з трьох лізоформ, K.A. Fagan et al. оцінили важливість кожної з ізоформ NОS у підтриманні вазомоторного тонусу легеневих судин та встановили, що саме ендотеліальна NОS відіграє найбільшу роль у регуляції легеневої циркуляції (K.A. Fagan et al., 1999). У звичайних умовах нейрональна та індуцибельна NO-синтази мають невелике значення для підтримання низького опору в легеневому руслі. Проте за патологічних умов, у разі тривалої гіпоксії, саме надмірна експресія та активність індуцибельної NОS в судинних гладеньком’язових клітинах сприяє ендотелій-залежній вазоконстрикції (M.E. Ward et al., 2005).

Останніми роками увагу дослідників привертає також ендогенний інгібітор NОS – асиметричний диметиларгінін. Використовуючи модель легеневої артеріальної гіпертензії (ЛАГ) за умови хронічної гіпоксії, у щурів виявили підвищений рівень асиметричного диметиларгініну та знижену активність специфічного ферменту диметиларгінін-диметиламіногідролази, що чітко корелювало з підвищеним тиском в легеневій артерії (L.G. Millat et al., 2003).

Отже, такі багатовекторні аспекти метаболізму NO створюють значні труднощі для оцінки концентрацій його активних сполук в крові хворих та їх інтерпретації у клінічних умовах. Інколи виникають протиріччя між низькими рівнями метаболітів NO та функціональним поліпшенням судинного тонусу, зокрема у хворих на ішемічну хворобу серця (О.А. Яковлева, Н.П. Савченко, 2004), або, навпаки, між ефективністю застосування препаратів-донаторів NO у хворих на системний червоний вовчак та проявами ЛАГ на фоні початкового високого рівня нітратів та нітритів у сироватці крові (О.О. Клекот, 2011).

На основі отриманих даних щодо важливості NO в легенево-судинній фізіології протягом довгих років розроблялася та впроваджувалася в практику нова стратегія лікування ЛАГ із використанням засобів, які могли б впливати на синтез оксиду нітрогену в організмі людини. Першим таким агентом став інгаляційний NO, застосування якого з 1999 року дозволено FDA (Food and Drug Administration – Управління з контролю харчових продуктів і лікарських засобів США) для терапії ЛАГ у новонароджених. Набули популярності також інгібітори фосфодіестерази 5-го типу, зокрема силденафіл, ефективність якого при ідіопатичній ЛАГ досліджено в подвійних сліпих плацебо-контрольованих дослідженнях. У стадії доклінічних досліджень знаходиться новий клас препаратів – активатори та інгібітори рГЦ.