Використання та порівняльна характеристика різних методів визначення антинуклеарних антитіл: непрямої імунофлуоресценції та проточної флуориметрії

Під час роботи було обстежено 150 пацієнтів віком від 19 до 86 років. Виявляли антинуклеарний фактор у реакції непрямої імунофлуоресценції (IIFT) на культурі клітин Hep-2 та на кріозрізах печінки приматів («Euroimmun», Німеччина); антинуклеарні антитіла (ANA) до окремих антигенів (dsDNA, Chromatin, Ribosomal P, SSA (52 кД, 60 кД), SSB, Sm, Sm/RNP, RNP (A), RNP (68), Scl-70, Jo-1, Centromere B) методом проточної флуориметрії (BioPlex 2200, «Біо-Рад»). Результати обох лабораторних тестів корелювали між собою. Найбільш чутливим методом є IIFT, що дає змогу використовувати його для скринінгу автоімунних захворювань сполучної тканини. Зіставлення типів імунофлуоресценції та результатів проточної флуориметрії показало, що для кожного типу світіння характерний певний набір автоантитіл, які виявляються методом проточної флуориметрії. Проте в реагентах BioPlex 2200 наявні не всі антигени ядра, які можливо виявити методом IIFT. Саме тому отримані результати можуть бути різноспрямованими. Багато антигенів ANA залишаються маловивченими, бо являють собою нестійкі конформаційні або комплексні білкові або рибонуклеопротеїнові структури. У цих випадках виявлення ANA можливе лише методом непрямої імунофлуоресценції.

Ключові слова: антинуклеарні антитіла, автоімунні захворювання.

Вважається, що на автоімунні захворювання сполучної тканини страждає близько 10-20% населення планети, і з невідомих причин рівень захворюваності зростає. Ризик виникнення цих патологій існує для всіх, але найбільш схильні до них жінки репродуктивного віку. Внесок автоімунних захворювань сполучної тканини в загальну довічну інвалідизацію становить 10%.

Антинуклеарні антитіла (ANA)¹ − гетерогенна група автоантитіл, що реагують із різними компонентами ядра (нуклеїновими кислотами, гістонами, білками ядерної мембрани, компонентами сплайсосом², рибонуклепротеїнами, білками ядерець і центромер). Наразі описано понад 100 різновидів ANA. Визначення антинуклеарних антитіл у сироватці крові є незамінним тестом у лабораторній діагностиці основних ревматичних захворювань. Підвищення рівня антинуклеарних антитіл характерне для ревматоїдного артриту, склеродермії, системного червоного вовчака, синдрому Шегрена, змішаного захворювання сполучної тканини, дерматоміозиту, поліміозиту, туберкульозу, ВІЛ-інфекції, інсулінозалежного цукрового діабету, хронічного активного гепатиту, множинного склерозу тощо. Тобто визначення ANA можливе не лише при системних ураженнях сполучної тканини, а також при деяких інфекційних, онкологічних, ендокринних захворюваннях та запальних процесах. Визначення ANA в деяких випадках має прогностичне значення й може використовуватися для оцінки активності автоімунного процесу і моніторингу терапії. Скринінгові дослідження ANA також рекомендовано проводити тим, чиї родичі страждають на автоімунні патології. У осіб цієї групи ризик захворювань підвищений. Своєчасна діагностика допоможе призначити більш ефективне лікування. Частота позитивної реакції на АNА для здорового населення становить приблизно 1-5%; серед осіб віком понад 65 років вона вища.

¹ANA (autoantibodies against cell nuclei) – антинуклеарні антитіла. ²Сплайсосома – структура, що складається з молекул РНК і білків та здійснює сплайсинг (видалення інтронів із попередників мРНК) (прим. ред.).

Нині існує багато методів для визначення АNA. Результати при їх застосуванні не завжди збігаються (хоча між ними і є позитивна кореляція) – адже тест-системи відрізняються:

• за антигенними субстратами, які використовуються в їх конструкції;
• за спектром антитіл, які визначаються;
• за виробниками.

Найпоширенішим методом для скринінгу є виявлення ANA в реакції непрямої імунофлуоресценції (IIFT)³. Для визначення специфічності виявлених антитіл використовують інші методи, серед яких проточна флуориметрія (BioPlex 2200) та імуноблотинг.

³IIFT (indirect immunofluorescence) – непряма імунофлуоресценція.

Метою дослідження був порівняльний аналіз результатів виявлення антинуклеарних антитіл при застосуванні різних лабораторних методів: реакції непрямої імунофлуоресценції та проточної флуориметрії.

Матеріали та методи

вверх

Під час роботи було обстежено 150 пацієнтів віком від 19 до 86 років. Виявляли:

• антинуклеарний фактор – за допомогою реакції непрямої імунофлуоресценції на культурі клітин Hep-2 та на кріозрізах печінки приматів (реактиви виробництва «Euroimmun», Німеччина) (рис. 1);
• антинуклеарні антитіла до окремих антигенів (dsDNA, Chromatin, Ribosomal P, SSA (52 кД, 60 кД), SSB, Sm, Sm/RNP, RNP (A), RNP (68), Scl-70, Jo-1, Centromere B) – за методом проточної флуориметрії (прилад BioPlex 2200 виробництва «Bio-Rad Laboratories», США).

Реакція непрямої імунофлуоресценції

Рисунок 1. Методика застосування реакції непрямої імунофлуоресценції (реактиви виробництва «Euroimmun», Німеччина)

 

Рисунок 1. Методика застосування реакції непрямої імунофлуоресценції (реактиви виробництва «Euroimmun», Німеччина)

Метод виявлення АНФ⁴ був розроблений Е.М. Таном (E.M. Tan, 1982), який використав як субстрат людську перещеплювану епітеліоїдну клітинну лінію Hеp-2. Ця клітинна лінія отримана з аденокарциноми гортані людини і являє собою великі поліплоїдні незроговілі плоскі епітеліоцити, що створюють моношар на пластику або склі. Відносна невибагливість цієї лінії, великі ядра та наявність усіх антигенів людини зробили метод непрямої імунофлуоресценції з використанням лінії Hep-2 основним для виявлення АНФ. Для цієї методики використовують також кріозрізи органів приматів (див. рис. 1).

⁴АНФ – антинуклеарний фактор.

Методика виконання реакції непрямої імуно­флуоресценції:

1. Розведення зразків сироватки фосфатно-сольовим буферним розчином із додаванням 0,05% твін-20, pH 7,2 (ФСБ-Т) у співвідношенні: 100 мкл ФСБ-Т + 11,1 мкл нерозведеного зразка. Для аналізу «Euroimmun» рекомендує використовувати зразки, починаючи з розведення 1 : 100.
2. Нанесення 25 мкл розведеного зразка сироватки в кожну реакційну зону полістиролового шаблону-підкладки (техніка TITERPLANE).
3. Інкубація зразків: помістити предметні скельця з біочіпами у відповідні заглиблення шаблону-підкладки. Витримати 30 хв за кімнатної температури (18-25°С).
4. Промивання. Ополоснути предметні скельця протягом 1 с під струменем ФСБ-Т та помістити їх відразу в кювету для промивання, яка містить ФСБ-Т, після чого промивати їх протягом 5 хв, використовуючи шейкер орбітального типу.
5. Нанесення по 20 мкл мічених флуоресцеїном антитіл до імуноглобулінів людини в кожну реакційну зону чистого шаблону-підкладки.
6. Інкубація кон’югату. Після промивання помістити предметне скельце з біочіпами в заглиблення шаблону-підкладки. Витримати 30 хв за кімнатної температури (18-25°С), оберігаючи скельце від впливу прямих сонячних променів.
7. Промивання згідно з пунктом 4.
8. Заливка. Нанести гліцерол на покривне скельце – краплі об’ємом 10 мкл на кожну реакційну зону (використовувати полістироловий шаблон). Розмістити предметне скельце біочіпами донизу на підготовлене покривне скельце.
9. Оцінка флуоресценції за допомогою мікро­скопа EUROStar. Об’єктив для зрізів органів − 20×, для клітинних субстратів − 40×. Фільтр збудження − 488 нм, кольоророздільний пристрій − 510 нм, блокуючий фільтр − 520 нм.

Інтерпретація. Результатом визначення АNA є титр, який являє собою значення останнього розведення сироватки, за якого зберігається значуща флуоресценція ядра. Чим більший знаменник дробу, тим більше розведення сироватки і тим більше антитіл у сироватці пацієнта. Високі титри розведення сироватки відображають високу афінність та концентрацію автоантитіл. У низьких титрах АНФ виявляється у 1-5% здорових осіб та родичів хворих із системними захворюваннями. Відсоток позитивних титрів збільшується з віком. Низькі титри АНФ можуть спостерігатися при багатьох інфекційних та онкологічних захворюваннях. Цінну клі­нічну інформацію надає тип флуоресценції. На сьогодні відомо понад 40 типів флуоресценції клітини, але на практиці використовують лише 6: гомогенний, периферичний, гранулярний (дрібно-/велико-), ядерцевий, крапчастий та цитоплазматичний. У лабораторії «Сінево» використовується класифікація, запропонована «Euroimmun» (Німеччина) (рис. 2).

Рисунок 2. Класифікація типів флуоресценції за даними фірми «Euroimmun», Німеччина

 

Рисунок 2. Класифікація типів флуоресценції за даними фірми «Euroimmun», Німеччина

Метод проточної флуориметрії (прилад BioPlex 2200 виробництва «Bio-Rad Laboratories», США)

В основі технології BioPlex 2200 лежить використання магнітних мікросфер розміром 8 мкм (рис. 3) та різних за ступенем флуоресценції барвників, які створюють унікальні за кольором панелі частинок («регіони»).

Рисунок 4. Вкриті антигеном частинки BioPlex 2200

 

Рисунок 4. Вкриті антигеном частинки BioPlex 2200

Частинки BioPlex 2200 вкриті лігандами (наприклад, антигенами, антитілами, аналітами тощо), специфічними для конкретного тесту (рис. 4).

Рисунок 5. Хід виконання методики BioPlex 2200

 

Рисунок 5. Хід виконання методики BioPlex 2200

Частинки з різними лігандами змішуються в одному наборі реагентів. Це дає змогу одночасно виявляти багато різних аналітів в одній пробі пацієнта. Детекція аналітів відбувається за рахунок використання флуоресцентної мітки.

Методика виконання проточної флуориметрії (рис. 5):

1. Проба пацієнта (5 мкл) автоматично вноситься в реакційну пробірку.
2. Додаються реагенти, проводиться інкубування за температури 37°C.
3. Стадія промивання.
4. Додається кон’югат, інкубування за температури 37°C.
5. Стадія промивання.
6. Додається ресуспендуючий буфер для частинок.
7. Етап зчитування результатів методом проточної флуориметрії.

Рисунок 6. Детекція результатів методу BioPlex 2200

 

Рисунок 6. Детекція результатів методу BioPlex 2200

У процесі зчитування мікросфери по черзі проходять через кювету (рис. 6), в якій визначається ступінь флуоресценції. Кожна частинка спочатку проходить через червоний промінь лазера, де відбувається розпізнавання, а потім – через зелений, на цій стадії підраховується кількість таких частинок. Ступінь флуоресценції вимірюється окремо для кожної частинки, яка проходить через репортерний лазер.

Результати та обговорення

вверх

Кореляція результатів різних методів виявлення ANA залежить від спектра антитіл, які виявляються в рамках різних методів. Під час визначення ANA методом IIFT можливе виявлення багатьох типів флуоресценції, кожен з яких, своєю чергою, може бути зумовлений наявністю великої кількості різних антитіл. Метод проточної флуориметрії дає змогу виявити автоантитіла до 13 антигенів: dsDNA, Cromatin, Ribosomal P, SSA (52 кДа), SSA (60 кДа), SSB, Sm, Sm/RNP, RNP (A), RNP (68), Scl-70, Jo-1, Centromere B. Ми здійснили порівняльну характеристику спектра антигенів, антитіла до яких виявляються за допомогою цих методів (табл. 1). Також наведено дані щодо спектра антигенів, антитіла до яких виявляються методом імуноблотингу (ANA-блотинг, реактиви виробництва «Euroimmun», Німеччина).

Таблиця 1. Порівняльна характеристика інформативності різних методів за спектром антигенів

 

Таблиця 1. Порівняльна характеристика інформативності різних методів за спектром антигенів

За наведеними даними, всі три методи можна застосовувати для виявлення антитіл до таких антигенів: dsDNA, Nucleosomes, Histones, U1-nRNP, Sm, Ro/SS-A, SS-B, Scl-70, CENP-B, Ribosomal P-proteins, Jo-1, RNP 70, -A, -C.

Антигени, антитіла до яких можуть бути вияв­лені лише методом IIFT: ssDNA, GP210, Lamin A, Lamin B, Lamin C, Lamin B receptor (флуоресценція ядерної мембрани); Ku, Mi-2 (дрібногранулярна на Hep-2 і специфічна на печінці приматів); RNA polymerases 1, U3-nRNP/fibrillarin (ядерцевий тип флуоресценції); Sp100, Sp140, PML, SUMO (крапки в ядрі); CENP-A (за допомогою приладу BioPlex та імуноблотингу виявляють антитіла до антигену CENP-B); Centrioles; M3, M5, M9 (за допомогою імуноблотингу виявляють антитіла до антигену М2).

Антигени, які не виявляються за допомогою BioPlex 2200, а результати IIFT можливо підтвердити імуноблотом: PM-Scl (ядерцевий тип флуоресценції), PCNA (ядерний антиген проліферуючих клітин), M2 (автоантитіла до мітохондрій).

Таблиця 2. Порівняння результатів проточної флуориметрії (BioPlex) та реакції непрямої імунофлуоресценції (IIFT)

 

Таблиця 2. Порівняння результатів проточної флуориметрії (BioPlex) та реакції непрямої імунофлуоресценції (IIFT)

Під час проведення роботи було оцінено 50 зраз­ків сироватки пацієнтів (41 жінка та 9 чоловіків), результати дослідження яких на ANA методом проточної флуориметрії були позитивними (табл. 2). Це підтверджує загальноприйняту думку про те, що жінки хворіють на системні захворювання сполучної тканини значно частіше, ніж чоловіки. При цьому 28 зразків дали позитивний результат лише за одним показником, 13 − позитивний результат за двома показниками, 9 пацієнтів мали позитивні результати за трьома і більше показниками. Вісім сироваток дали негативний результат за методом IIFT (< 1 : 100) та позитивні результати за методом проточної флуориметрії (табл. 3), але показники при цьому були низькими (незначно вищі, ніж показники «сірої зони»). Таким чином, у цьому випадку проточна флуориметрія виявилася більш чутливим методом.

За флуоресценції гомогенного типу найбільшу кількість становили антитіла до dsDNA та Chromatin. Із 14 позитивних за методом IIFT 13 мали антитіла до dsDNA та 9 – до хроматину. Також у меншій кількості спостерігалися антитіла до інших антигенів: SSA, SSB, Cent B, Sm, Sm/RNP, RNP. Це можна пояснити тим, що частіше спостерігаються змішані типи флуоресценції, а гомогенний тип візуально сприймається краще, ніж дрібногранулярний чи інші.

Із 8 пацієнтів, які мали великогранулярний тип імунофлуоресценції, 5 мали антитіла до RNP, 3 − до Sm/RNP (високі значення), але 5 мали антитіла до dsDNA і 4 − до Chromatin (низькі значення).

Із 12 пацієнтів, які мали дрібногранулярний тип флуоресценції, у 10 виявлено антитіла до SSA, кілька пацієнтів мали антитіла до SSB (2 зразки), dsDNA (3), Sm/RNP (2), RNP (1), Jo-1 (2 зразки).

Із 3 пацієнтів, у яких метод IIFT виявив центромерний тип флуоресценції, всі троє мали антитіла до Cent B, хоча 2 мали ще й позитивний результат щодо dsDNA з низькими значеннями.

У 3 пацієнтів метод IIFT виявив антитіла до ядерної мембрани, а проточна флуориметрія – антитіла до різних антигенів. Це пов’язано зі змі­ша­ними типами флуоресценції, адже проточна флуориметрія не дає змоги виявити антигени ядерної мембрани.

У 2 пацієнтів, зразки яких показали ядерцевий тип світіння при IIFT, методом проточної флуо­риметрії виявлено антитіла до dsDNA і RNP із низькими значеннями. Антигени, що забезпечують візуалізацію ядерець при IIFT, у проточній флуориметрії не представлені (PM-Scl, RNA polymerase 1, U3-nRNP/fibrillarin).

У всіх 3 пацієнтів, зразки яких показали світіння, характерне для Scl-70 (світіння ядра та ядерець дрібногранулярне), проточна флуориметрія показала наявність антитіл до Scl-70.

Із 4 пацієнтів, зразки яких показали цитоплазматичний тип світіння в IIFT, 2 мали високі титри антитіл до Jo-1 за даними проточної флуориметрії, що збігалося з картиною флуоресценції. Також усі 4 пацієнти мали антитіла до SSA (у 2 − > 8 – змішаний тип світіння, у 2 – низькі значення).

Найчастіше виявляли антитіла до dsDNA (28), SSA (24) та до RNP (13).

Ми дослідили методом IIFT 100 зразків сироваток із негативними результатами проточної флуо­риметрії. За результатами IIFT 30% мали низькі титри (1 : 100) імунофлуоресценції (переважно гранулярний тип). Низькі титри антинуклеарних антитіл можуть спостерігатися при багатьох автоімунних, інфекційних та онкологічних захворюваннях, у родичів хворих із системними захворюваннями та в 1-5% здорових людей. Відсутність високих титрів антинуклеарних антитіл знижує ймовірність системного ревматичного процесу і може використовуватися радше для виключення, ніж для підтвердження діагнозу. У 6 пацієнтів із 100 (6%) виявлено значні титри ANA (табл. 4). В одному випадку це була інтенсивна флуоресценція ядерцевого типу (титр 1 : 3200). Це пояснюється браком антигенів ядерець (PM-Scl, RNA polymerase 1, U3-nRNP/fibrillarin) у реагентах для BioPlex 2200. У двох сироватках було виявлено за результатом IIFT поодинокі крапки в ядрах. Це також пояснюється браком у реагентах для BioPlex антигенів Sp100, Sp140, PML, SUMO. Ще в одному випадку світіння було дрібногранулярним, характерним для антигену Mi-2 (центральний компонент мультибілкового комплексу NuRD, регулятор транскрипції), якого також немає у реагентах для BioPlex. У 4 випадках простежувався гомогенний тип флуоресценції з титром 1 : 1000, що, найімовірніше, пов’язано з наявністю антитіл до ssDNA, яка не представлена в реагентах для BioPlex 2200 (у хроматині DNA (ДНК) перебуває у вигляді двоспіральної структури).

Також цілком імовірно, що розбіжність результатів IIFT та проточної флуориметрії пов’язана з тим, що під час виготовлення реагентів для BioPlex 2200 та виділення антигену втрачається велика кількість конформаційних і міжмолекулярних антигенних домінант.

Висновки

вверх

1. Аналіз результатів виявлення антинуклеарних антитіл за методами IIFT та проточної флуоримет­рії показав, що результати в більшості випадків збігаються.
2. Найбільш чутливим методом виявлення ANA є реакція непрямої імунофлуоресценції. Цей метод пропонує найбільш широкий спектр антигенів для виявлення ANA. За допомогою IIFT можливе виявлення великої кількості типів світіння, кожен з яких, своєю чергою, може бути зумовлений великою кількістю різних антитіл. Саме тому цей метод доцільно використовувати для скринінгу ANA.
3. Зіставлення типів імунофлуоресценції в IIFT і результатів проточної флуориметрії дає змогу конкретизувати антигенну специфічність антитіл, виявлених в IIFT.
4. Показано, що для кожного типу флуоресценції характерний певний набір автоантитіл, які можуть бути виявлені за допомогою проточної флуоримет­рії, імуноблотингу та імуноферментного аналізу.
5. Проте необхідно пам’ятати, що в реагентах BioPlex 2200 наявні не всі антигени ядра, які можливо виявити методом IIFT. Саме тому отримані результати можуть бути різноспрямованими.
6. Багато антигенів ANA залишаються мало­вив­ченими, адже являють собою нестійкі конформаційні або комплексні білкові або рибонуклеопротеїнові структури. У цих випадках виявлення ANA можливе лише методом непрямої імунофлуоресценції. Основні типи світіння дають можливість визначити групу антигенів, до яких наявні антитіла.

Список літератури

1. Александрова Е.Н. [и др.]. Автоматизированный анализ антинуклеарных антител методом непрямой реакции иммунофлюоресценции с использованием Hep-2 клеток // Клиническая лабораторная диагностика. − 2015. − Т. 60, № 3. − С. 30-35.

2. Алифирова В.М. [и др.]. Антитела к нативной и денатурированной ДНК при рассеянном склерозе // Журнал неврологии и психиат­рии им. С.С. Корсакова. − 2011. − Т. ІІІ, № 2. − Вып. 2, Рассеянный склероз. − С. 16-20.

3. Боброва І.А. Кінетика антинуклеарних антитіл у хворих на гепатит С з ознаками тиреопатії // Архів клінічної медицини. − 2012. − № 2. − С. 28-30.

4. Пашнина И.А., Криволапова И.М., Тузанкина И.А., Череш­нев В.А. Использование различных лабораторных методов для опре­деления антинуклеарных антител у пациентов с аутоиммунными заболеваниями соединительной ткани // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. − 2012. − № 3 (85), ч. 2 − С. 143-147.

5. Костенко И.Г. Лабораторная диагностика ревматических болезней // Therapia. Український медичний вісник: науковий журнал. − 2016. − № 3, ч. 2. − С. 21-24.

6. Лапин С.В., Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диа­гностика аутоиммунных заболеваний. – СПб: Человек, 2010. – 272 с.

7. Пашнина И.А. Анализ результатов определения антинуклеарных антител различными лабораторными методами // Вестн. Урал. мед. акад. наук. – 2011. – № 2/1. – С. 186-187.

8. Лапин С.В., Тотолян А.А. Антинуклеарные антитела: лабо­раторные тесты и диагностическое значение // Медицинская иммунология. − 2001. – Т. 3, вып. № 1. − С. 35-50.

9. Лапин С.В., Мазинг А.В., Булгакова Т.В., Напалкова О.С., Первакова М.Ю., Холопова И.С., Маслянский А.Л., Тотолян А.А. Выявление антинуклеарных антител: международные рекомендации и собственный опыт // Медицинский алфавит. – 2014. – Т. 3, № 15. − С. 40-45.

10. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. // Тер. архив. − 2010. − Vol. 85, № 5. − P. 5-9.

11. Созина А.В., Иливанова Е.П., Шульман A.М., Шульман М.А., Шемеровская Т.Г., Лапин С.В., Тотолян А.А. // Клин. лаб. диаг. − 2008. − Vol. 5. − P. 44-47.

12. Созина А.В., Неустроева Ю.А., Тихомирова Т.А., Лапин С.В. // Мед. иммунология. − 2007. − Vol. 9, № 1. − P. 69-76.

13. Лапин С.В., Тотолян А.А. Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний // Terra Medica nova. – 2007. − № 3 (15).

14. Вірстюк Н.Г., Черкашина О.Є. Діагностичне значення антинуклеарних антитіл у крові хворих із хронічною серцевою недостатністю // Лабораторна діагностика. − 2008. − № 3. − С. 30-32.

15. Вірстюк Н.Г., Черкашина О.С. Зміни показників клітинного імунітету, антинуклеарних антитіл та туморнекротизуючого фактора альфа у хворих із хронічною серцевою недостатністю // Галицький лікарський вісник. − 2014. − Т. 21, № 4. − С. 15-17.

16. Agmon-Levin N., Damoiseaux J., Kallenberg C., Sack U., Witte T. et al. // Ann. Rheum. Dis. − 2014. − Vol. 73, № 1. − P. 17-23.

17. Bossuyt X., Hendrickx A., Frans J. // Arthritis Rheum. − 2005. − Vol. 53, № 6. − P. 987-988.

18. Damoiseaux J.G., Tervaert J.W. // Autoimmun. Rev. − 2006. − Vol. 5, № 1. − P. 10-17.

19. Wiik A., Cervera R., Haass M., Kallenberg C., Khamashta M. et al. // Lupus. − 2006. − Vol. 15, № 7. − P. 391-396.

20. Bernstain R.M., Steigerwald J.C., Tan E.M. Association of antinuclear and antinucleolar antibodies in progressive systemic sclerosis // Clin. Еxp. Imm. – 1982. – Vol. 48. – P. 43-51.

21. Parker J.C., Burlingame R.W., Bunn C.C. Prevalence of antibodies to Ro-52 in a serologically defined population of patients with systemic sclerosis // J. Autoim. Diseases. – 2009. – Vol. 6. – P. 1740-2557.

22. Peene I., Meheus L., Veys E.M., De Keyser F. Detection and identification of antinuclear antibodies (ANA) in a large and consecutive cohort of serum samples referred for ANA testing // Ann. Rheum. Dis. – 2001. – Vol. 60. – Р. 1131-1136.

The use and comparative characteristics of different methods for determining antinuclear antibodies: the method of indirect immunofluorescence and flow fluorimetry

In the study 150 patients aged 19 to 86 were examined. The antinuclear factor in the reaction of the indirect immunofluorescence on Hep-2 cell culture and on the cryosections of the primate liver (Euroimmun, Germany); the antinuclear antibodies to the specific antigens (dsDNA, Chromatin, Ribosomal P, SSA (52 kDa, 60 kDa), SSB, Sm, Sm/RNP, RNP (A), RNP (68), Scl-70, Jo-1, Centromere B) by the flow fluorimetry (BioPlex 2200, Bio-Rad) were investigated. The results of both laboratory tests correlated with each other. The most sensitive method is IIFT, which gives the opportunity of using it for the screening of autoimmune connective tissue diseases. The comparison of the immunofluorescence types and flow fluorimetry results showed that the set of antibodies detected by the flow fluorimetry is typical for each type of glow. However, not all the antigens of the core, which can be detected by IIFT, present in the BioPlex 2200 reagents. Therefore, the results may be multidirectional. Many ANA antigens remain poorly studied, as they are conformational unstable or complex protein or ribonucleoprotein structures. In these cases, ANA detection is possible only by indirect immunofluorescence.

Keywords: autoantibodies, autoimmune diseases.

Использование и сравнительная характеристика различных методов определения антинуклеарных антител: непрямой иммунофлюоресценции и проточной флуориметрии

Во время проведения работы было обследовано 150 пациентов в возрасте от 19 до 86 лет. Определяли антинуклеарный фактор в реакции непрямой иммунофлюоресценции (IIFT) на культуре клеток Hep-2 и на криосрезах печени приматов («Euroimmun», Германия); антинуклеарные антитела (ANA) к отдельным антигенам (dsDNA, Chromatin, Ribosomal P, SSA (52 кД, 60 кД), SSB, Sm, Sm/RNP, RNP (A), RNP (68), Scl-70, Jo-1, Centromere B) методом проточной флуориметрии (BioPlex 2200, «Био-Рад»). Результаты обоих лабораторных тестов коррелировали между собой. Наиболее чувствительным методом является IIFT, что дает возможность его использования для скрининга аутоиммунных заболеваний соединительной ткани. Сопоставление типов иммунофлюоресценции и результатов проточной флуориметрии показало, что для каждого типа свечения характерен определенный набор аутоантител, которые определяются методом проточной флуориметрии. Однако в реагентах BioPlex 2200 присутствуют не все антигены ядра, которые возможно выявить методом IIFT. Поэтому полученные результаты могут быть разнонаправленными. Многие антигены ANA остаются малоизученными, так как представляют собой нестойкие конформационные или комплексные белковые или рибонуклеопротеиновые структуры. В этих случаях определение ANA возможно только методом непрямой иммунофлюоресценции.

Ключевые слова: антинуклеарные антитела, аутоиммунные заболевания.